Zellkultur-Protokoll: Anhaftende vs. Suspensionszellen & Asepsis-Techniken

Zellen in Kultur sind entweder eine in Suspension kultivierte Form, wie Blutzellen, oder Zellen wie Fibroblasten, die eine Oberfläche benötigen, an der sie haften können. Einige der Oberflächen müssen möglicherweise je nach Zelltyp und Studie mit verschiedenen extrazellulären Matrixen beschichtet werden. Alle Zellkulturen müssen unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden.

Optimale Umgebung

Die meisten Zelltypen können in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) oder Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mit Zugabe von 10 Prozent fetalen Kälberserum, 2 Millimol der Aminosäure Glutamin und Antibiotika, zum Beispiel 100 Einheiten Penicillin und 0,1 Milligramm pro Milliliter Streptomycin, kultiviert werden. Zellen werden in ihrem Medium in einem feuchten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent Kohlendioxid gehalten.

Teilen (Splitting)

Zellen sollten täglich auf Infektion, Tod oder Wachstum überprüft werden. Sobald die Gewebekulturflasche zu 80 Prozent mit Zellen bedeckt ist, sollten die Zellen geteilt werden, um die Gesundheit der Zellen und die Log-Phase des Wachstums zu erhalten. Medium wird entfernt und die Zellen werden in gepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Anhaftende Zellen erfordern die Zugabe von Trypsin und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), um Zelladhäsionsproteine zu entfernen. Sanftes Schütteln sollte die Zellen lösen. Medium muss hinzugefügt werden, um die Trypsin/EDTA-Lösung zu neutralisieren.

Subkultivierung

Die verdünnten Zellen und die Trypsin/EDTA-Lösung können zentrifugiert werden, um die Zellen zu pelletieren und zu waschen. Die Zellen können in Medium resuspendiert und verdünnt und in neue Flaschen umgesetzt werden. Jedes Mal, wenn die Zellen geteilt werden, wird die Passage-Nummer der Zellen um eins erhöht.

Medienwechsel

Medium sollte zweimal pro Woche gewechselt werden, indem das alte Medium entfernt und durch neues, erwärmtes Medium ersetzt wird.