Biotinylierungs-Protokoll für Oberflächenproteine: Ein umfassender Leitfaden

Biotinylierung nutzt die Fähigkeit des löslichen Vitamins Biotin, an Zellproteine zu binden. Biotin bindet an das Protein Streptavidin und ist daher in der Zellbiologie nützlich, um Zellproteine zu visualisieren. Biotinylierung ermöglicht die sichere Kennzeichnung von Proteinen im Vergleich zu Techniken wie Radioaktivität und beeinträchtigt nicht die normale Funktion der Zelle. Es ermöglicht Forschern, Zellproteine wie Rezeptoren zu untersuchen, was ein größeres Verständnis von Krankheiten und Krankheitsprozessen ermöglicht.

Suspendierte Zellen kennzeichnen

Zellen mit eiskalter gepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen, um Verunreinigungen zu entfernen. Puffer, die Tris und Glycin enthalten, konkurrieren mit der Biotinylierung und sollten vermieden werden. Um die Biotinylierung interner Proteine zu vermeiden, kann die Kennzeichnung bei 4 Grad Celsius oder in Gegenwart von Azidid durchgeführt werden. Zellen in PBS und dem löslichen Biotin Sulfo-NHS-LC-Biotin resuspendieren.

Anhaftende Zellen kennzeichnen

Zellen mit PBS waschen und mit einem Produkt wie Sulfo-NHS-LC-Biotin inkubieren. Die Zellen werden dann in eine Schale geschabt und in einem Puffer mit dem Detergent Triton-X 100 lyisiert und für die Visualisierung vorbereitet.

Beschriftete Zellen vorbereiten

Nach der Inkubation werden die Zellen zu einem Pellet zentrifugiert und mit PBS gewaschen. Die Zellen werden in PBS resuspendiert und mit IgG-Sepharose-Gel gereinigt. Das gebundene Protein wird in Ladepuffer verdünnt und auf 100 Grad Celsius erhitzt.

Zellen visualisieren

Verdünnte Proteine können mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gefolgt von Blotting mit der Protein- und Enzymmischung Streptavidin-Horseradishperoxidase visualisiert werden. Blots werden mit einer chemischen Reaktion --- Chemilumineszenz --- visualisiert, die Licht emittiert. Die Spezifität der Biotinylierung kann mit Antikörpern für das untersuchte Protein bestätigt werden.