Die Hydrolyse von N-Benzoyl-DL-Arginin-p-nitroanilid (BAPNA) durch Trypsin folgt der klassischen Michaelis-Menten-Kinetik und ist ein Standardassay für Serinprotease-Aktivität.
Kinetische Phasen
- Anfangsgeschwindigkeit (V₀) Phase: [S] >> Kₘ; Rate ist konstant und proportional zu [E]. Lineare Produktbildung (p-Nitroanilin-Freisetzung gemessen bei 410 nm).
- Übergangsphase: Substratkonzentration nimmt ab; Rate verlangsamt sich, da die Enzymsättigung abnimmt.
- Plateau: Substrat erschöpft; Reaktion nähert sich der Vollendung.
Mathematische Beschreibung
Integrierte Michaelis-Menten-Gleichung für den Fortschrittskurve:
t = (Kₘ/Vₘₐₓ) ln([S]₀/[S]ₜ) + ([S]₀ - [S]ₜ)/Vₘₐₓ
Wobei [S]₀ = anfängliche Substratkonzentration, [S]ₜ = Konzentration zum Zeitpunkt t.
Parameterbestimmung
- Anfangsraten bei variierender [S]₀ messen.
- Lineweaver-Burk (1/v vs 1/[S]), Hanes-Woolf ([S]/v vs [S]) oder Eadie-Hofstee (v vs v/[S]) Plots ergeben Kₘ und Vₘₐₓ.
- kcat = Vₘₐₓ/[E]ₜ; katalytische Effizienz = kcat/Kₘ.
Experimentelle Überlegungen
- Standardbedingungen: pH 8,0 (Tris-HCl), 37 °C.
- Ca²⁺ stabilisiert Trypsin; Chelatoren (EDTA) vermeiden.
- Inner-Filter-Effekt bei hoher [S] oder Produktanreicherung – mathematisch korrigieren oder Proben verdünnen.
Dieser Assay ist grundlegend für Enzymcharakterisierung, Inhibitor-Screening und Bioprozessüberwachung.
