Die Durchflusszytometrie beinhaltet das Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung, unter Verwendung einer Lichtanregungsquelle wie einem Laser, um die physikalischen Eigenschaften einzelner Partikel zu messen und zu analysieren. Die Durchflusszytometrie wird vorwiegend auf die Zellanalyse angewendet, und die analysierten Eigenschaften umfassen Zellgröße, Körnigkeit und Fluoreszenzintensität. Wesentliche Detektionsmethoden, die in der Durchflusszytometrie verwendet werden, umfassen vorwärtsgestreutes Licht, seitlich gestreutes Licht und Fluoreszenz.
Durchflusszytometer
- Ein Durchflusszytometer besteht aus Fluidsystem, Optiksystem und Elektroniksystem. Das Fluidsystem ist verantwortlich für den Transport der Probenstrom zum Laserstrahl zur Befragung. Das Optiksystem enthält Laser und optische Filter, die Proben beleuchten und Lichtsignale zu den entsprechenden Detektoren lenken. Dieses erkannte Licht wird vom Elektroniksystem in elektronische Signale umgewandelt, zur Interpretation durch den Computer.
Vorwärtsgestreutes Licht
- Diffrakiertes Licht, das in Vorwärtsrichtung gestreut wird, wird von einer Photodiode namens Vorwärtsstreukanal (FSC) in etwa 20 Grad von der Achse des Laserstrahls erkannt. Vorwärtsgestreutes Licht ist direkt proportional zur Partikeloberfläche und wird als Indikator für die Zellgröße sowie zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen verwendet. Aufgrund dieser Eigenschaften wird FSC in der Immunphänotypisierung als Auslöser der Signalverarbeitung angewendet.
Seitlich gestreutes Licht
- Seitlich gestreutes Licht bezieht sich auf Licht, das an jeder zellulären Schnittstelle gebrochen wird, das in etwa 90 Grad von der Laserstrahlachse vom Seitestreukanal (SSC) gemessen und dann durch einen Strahlteiler zum entsprechenden Detektor umgeleitet wird. Seitlich gestreutes Licht entspricht grob der Zellkörnigkeit oder inneren Komplexität und wird verwendet, um den körnigen Gehalt von Zellen zu bestimmen. Seitlich und vorwärts gestreutes Licht werden in Kombination verwendet, um zwischen verschiedenen Zelltypen zu unterscheiden.
Fluoreszenz
- Fluoreszenz liefert sowohl quantitative als auch qualitative Informationen über intrazelluläre Moleküle wie Zytokine und DNA sowie Zelloberflächenrezeptoren, indem Fluorochrom-Label verwendet und bei verschiedenen Wellenlängen gemessen wird. Jedes Fluorochrom-Label hat einen spezifischen Wellenlängenbereich, bei dem Licht absorbiert wird, genannt Absorptionsspektrum. Fluoreszenz funktioniert, wenn ein Photon von Licht von einem aufgeregten Elektron nach Lichtabsorption emittiert wird.
