Kompetitive Bindungsanalyse: Protokoll und Anwendungen

Die kompetitive Bindungsanalyse ist ein Experiment, das die Bindungskapazität von Proteinen oder Chemikalien für spezielle Proteine auf einer Zelloberfläche bestimmt, sogenannte Rezeptoren. Die Methode wird häufig in der medizinischen Forschung verwendet, kann aber auch bestimmen, welche Medikamente an Rezeptoren binden und die Rezeptoraktivität verändern, was wiederum das Zellverhalten verändern kann.

Zellvorbereitung

Zellen in eiskalte gepufferte Kochsalzlösung (PBS) resuspendieren. Protein Konzentration messen, um gleiche Proteinspiegel mit einem speziellen kommerziell erhältlichen Protein-Assay zu bestätigen.

Assay

Ein radioaktiv markiertes Protein, von bekannt ist, dass es an den Rezeptor bindet, das Ligand, zur Zell- oder Gewebesuspension hinzufügen. Den Wettbewerber hinzufügen, welcher das Testmedikament oder das untersuchte Protein ist, und mit dem radioaktiven Ligand und der Zellsuspension inkubieren. Eine Bandbreite von Konzentrationen des Testmedikaments sollte untersucht werden. Nach der Inkubation gebundenes und ungebundenes Ligand trennen und Radioaktivität messen.

Datenanalyse

Das übliche zu bestimmende Maß ist die Hälfte der maximalen Konzentration, die den Rezeptor inhibiert, auch bekannt als IC50. Dies wird berechnet, indem die Konzentrationen auf einer logaritmischen Skala auf der X-Achse eines Diagramms aufgetragen werden, während die Y-Achse den Prozentsatz der Inhibition repräsentiert; eine sigmoidale Kurve, die eine S-Form ist, sollte erzeugt werden. Der IC50 ist der 50-Prozent-Inhibitionspunkt, und die entsprechende Konzentration kann vom Diagramm abgelesen werden.