NADH-Messung: Methoden und Bedeutung im Zellstoffwechsel

NAD und NADH sind beide Pyridin-Nukleotide, die am Stoffwechsel beteiligt sind. NADH und NAD sind Co-Enzyme, die in den Mitochondrien, den Kraftwerken der Zelle, vorkommen. Sowohl NAD als auch NADH sind an zellulären Reaktionen wie Atmung und Photosynthese beteiligt, bei denen Energie und Wasserstoff erzeugt werden. NAD und NADH treiben biochemische Reaktionen an, die eine Reihe von Enzymen erfordern, um ATP zu produzieren, die Hauptenergiequelle in Zellen.

Dinge, die Sie benötigen

• Zellen oder Gewebe unter Untersuchung
• NADH-Testkit
• Phosphatpufferlösung
• Trockeneis
• Heizblock
• 96-Well-Platte
• Zentrifuge
• Beschriftete Röhrchen
• Plattenlesegerät
• Wirbler
• Bekannte NADH-Konzentration

Anleitung

1. Assay: Waschen Sie die untersuchten Zellen oder das Gewebe mit kalter Phosphatpufferlösung (PBS). Extrahieren Sie Zellen oder zerbrechen Sie Gewebe in Extraktionspuffer, indem Sie die Mischung für 20 Minuten auf Trockeneis legen und dann für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie dies.

2. 10 Sekunden wirbeln. 5 Minuten in einer Zentrifuge zentrifugieren, um Zell- oder Gewebetrübsche zu pelletieren. Überstand entfernen, die flüssige Phase, und die Flüssigkeit in ein sauberes Röhrchen geben.

3. Den Überstand durch einen Spezialfilter filtern, um Enzyme zu entfernen, die NADH abbauen.

4. 200 Mikroliter entfernen, in ein sauberes Röhrchen geben und 30 Minuten bei 60 Grad Celsius in einem Heizblock erhitzen, um NAD zu denaturieren. Abkühlen, zentrifugieren und flüssige Phase entfernen. 50 Mikroliter in eine 96-Well-Platte übertragen; jede Probe sollte in Duplikat oder Triplikat vorliegen. Um das Gesamt-NAD (NADt) zu bestimmen, nicht erhitzen.

5. Cycling-Mix vorbereiten und zur 96-Well-Platte hinzufügen. Mischen und 5 Minuten inkubieren. 10 Mikroliter Entwickler hinzufügen und bis zu 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Stopp-Lösung hinzufügen. Farbänderung mit einem Plattenlesegerät oder Fluorimeter je nach Kit auslesen.

Standardkurve und Berechnung

1. Eine Standardkurve vorbereiten, indem eine bekannte NADH-Konzentration genommen und in Extraktionspuffer verdünnt wird. In verschiedene Konzentrationen verdünnen, wobei das Endvolumen gleich dem der Testproben bleibt. Auf derselben 96-Well-Platte wie die Testproben platzieren. Optische Dichte auslesen.

2. Standardkurvendiagramm zeichnen mit Konzentration auf der X-Achse und optischer Dichte auf der Y-Achse. Einen Durchschnitt jeder Testprobe nehmen und die Konzentration vom Standardkurvendiagramm ablesen.

3. Das NAD/NADH-Verhältnis berechnen, indem das Gesamt-NAD (NADt) von NADH abgezogen und dann durch NADH geteilt wird.