QuikChange-Mutagenese ist der Markenname eines Kits, das in der Biotechnologieforschung verwendet wird, um genetische Mutationen oder DNA-Veränderungen zu induzieren. Agilent Technologies ist das Unternehmen hinter dem Produkt, das in zwei Versionen erhältlich ist, QuikChange II und QuikChange Lightning. Beide Kits enthalten eine Pufferslösung, das Enzym DNA-Polymerase, Farbreagenzien, DNA-Sequenzen oder Primer und Zellproben.
Protokoll der Mutantenstrang-Synthese-Reaktion
- Techniker synthetisieren zwei Oligonukleotide oder kurze DNA-Sequenzen, die die gewünschte Mutation enthalten. Dann bereiten sie die Kontrollreaktion mit den DNA-Sequenzen, der dNTP-Mischlösung und dem Enzym DNA-Polymerase vor, indem sie destilliertes Wasser hinzufügen. Später bereiten sie eine Reihe von Beispielreaktionen unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von doppelsträngiger DNA (dsDNA) vor, während sie die Konzentration von Primer oder Oligonukleoten gemäß den Herstelleranweisungen konstant halten. Sie halten die Proben bei 203 Grad F für 30 Sekunden. Die Probe, die das DNA-Segment Nummer zwei enthält, wird auch unter Temperaturzyklus getestet, einer Technik, bei der sich die Temperatur während kurzer Zeiträume ändert. Schließlich werden die Proben für zwei Minuten auf Eis gelegt.
Protokoll der Dpn I-Verdauung der Amplifikationsprodukte
- Das Dpn I-Restriktionsenzym schneidet die DNA an spezifischen Stellen. Ein Mikroliter dieses Enzyms wird direkt unter seine standardmäßige Mineralölauflage in jede Amplifikationsreaktion gegeben, unter Verwendung einer Mikropipette oder einer spezialisierten aerosolresistenten Pipettenspitze. Allerdings ist eine Mineralölauflage nur erforderlich, wenn der Thermocycler, ein Gerät zur Amplifikation von DNA-Segmenten, keine Hot-Top-Anordnung hat. Die Reaktion wird vorsichtig gemischt und später für eine Minute in eine Mikrozentrifuge gelegt. Danach werden die Proben bei 98,6 Grad F für eine Stunde inkubiert.
Protokoll der Transformation von XL1-Blue Superkompetenten Zellen
- XL1-Blue ist eine Tetracyclin-resistente Zelllinie, die mit den QuikChange-Mutagenese-Kits geliefert wird. Während dieses Protokolls tauen Techniker die Zellen auf, die zuvor bei -112 Grad F auf Eis gehalten wurden. Dann fügen sie einen Mikroliter der Dpn I-behandelten DNA hinzu, erhitzen sie auf 107,6 Grad F für 45 Sekunden und legen die Reaktion für zwei Minuten auf Eis. Nach diesem Verfahren fügen Techniker eine Zubereitung von NZY (Caseinhydrolysat und Hefeextrakt) hinzu, das auf 107,6 Grad F vorerwärmt wurde, und inkubieren für eine Stunde. Die Zubereitung wird dann auf Agar-Gel-Platten gelegt und bei 98,6 Grad F für 16 Stunden inkubiert.
