Zelllebensfähigkeitsmessung: Ein umfassender Leitfaden

Bei den meisten biologischen Experimenten mit Zellkultur umfasst ein entscheidender Schritt das Wissen, welche Zellen in Ihrer Probe lebend und welche tot sind. Der Farbausschluss ist die beliebteste Methode zur Messung der Zelllebensfähigkeit. Der Farbausschluss basiert auf der Theorie, dass lebende Zellen intakte Membranen enthalten und tote Zellen nicht, wodurch tote Zellen den Farbstoff ins Zytoplasma aufnehmen. Es gibt verschiedene Farbstoffe und Protokolle, und die von Ihnen gewählten Methoden sollten auf Kosten, Empfindlichkeit, Einfachheit und Dauer des Verfahrens basieren. Trypanblau ist ein häufig verwendeter Farbstoff zur Messung der Zelllebensfähigkeit, da das Verfahren in fünf bis zehn Minuten durchgeführt werden kann und nur die Kosten des Farbstoffreagenzials verursacht.

Anleitung

1. • Gewinnen Sie ein Pellet der Zellen, die Sie messen.

   • Suspendieren Sie das Zellpellet in PBS, um etwa 5 x 10^5 Zellen/ml zu erhalten. PBS wird verwendet, weil Lebensfähigkeitsmessungen genauer sind, wenn sich Zellen in einer serumfreien Umgebung befinden; Serumproteine können ebenfalls färben und irreführende Ergebnisse liefern.

   • Geben Sie gleiche Teile Zellsuspension in PBS zu gleichen Teilen 0,4%igen Trypanblau-Farbstoff, um eine 1-zu-2-Verdünnung zu erhalten (Beispiel: 100 µl Zellen zu 100 µl Trypanblau) und mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren.

   • Inkubieren Sie die Mischung für weniger als drei Minuten bei Raumtemperatur. Wenn Zellen nach etwa fünf Minuten gezählt werden, ist die Lebensfähigkeit aufgrund von Zelltod ungenau.

   • Füllen Sie, sobald das Deckglas bereits aufgesetzt ist, jede Seite einer Blutzählkammer mit der Zellsuspension. Typischerweise benötigt jede Seite 10 bis 20 µl.

   • Platzieren Sie die Blutzählkammer auf dem Objekttisch eines Lichtmikroskops und fokussieren Sie auf die Zellen.

   • Jede Seite der Blutzählkammer enthält mehrere Quadrate. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in einem Quadrat der Blutzählkammer. Zählen Sie dann die Anzahl der nicht lebensfähigen (blauen) und lebensfähigen (klaren) Zellen separat, im selben Quadrat.

   • Berechnen Sie den Prozentsatz der lebensfähigen Zellen im Quadrat, indem Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch die Anzahl der Gesamtzellen teilen und mit 100 multiplizieren. Tun Sie dies für mehrere Quadrate auf der Blutzählkammer, um einen durchschnittlichen Lebensfähigkeitswert zu erhalten.