Maltose-Bindungsprotein (MBP) Reinigung: Protokolle und Techniken

MBP oder Maltose-Bindungsprotein kommt in den Bakterien Escherichia coli vor, die Teil der Darmflora von Menschen und Tieren sind. Die Reinigung von MBP umfasst eine Reihe von Verfahren, die darauf abzielen, die Bestandteile des Proteins zu trennen. In der Molekularbiologie ist die MBP-Reinigung ein wichtiger Prozess für die Untersuchung der Struktur und Funktion dieses Proteins. MBP-Reinigungsprotokolle umfassen die Reinigung von MBP-fusionierten Proteinen, die kleinschalige MBP-Fusion und die Reinigung des Maltose-Bindungsprotein-Fusion-Tags.

Reinigung von MBP-fusionierten Proteinen

Während dieses Protokolls waschen Techniker 20 ml des Polymers Amylose-Harz mit einer Tris-Lösung bei pH 7,4, Natriumchlorid, Mercaptoethanol (ME) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), so Protocols Online. Zellproben werden hinzugefügt, zentrifugiert und mittels Gelelektrophorese analysiert. Proben werden auch in einem Chromatographen analysiert, wo Techniker die Bestandteile der Lösung eluieren oder beobachten, während sie durch die Chromatographiesäule fließen.

Kleinschalige MBP-Fusion-Protein-Reinigung

Laut der Hebräischen Universität Jerusalem verwenden Biologen das Reagenz Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG), zentrifugieren Zellkultur für 10 Minuten bei 8.000 Umdrehungen pro Minute bei 39,2 Grad Fahrenheit. Später entfernen sie die Überstandsflüssigkeit und mischen kalten PBS-Puffer zur Probe, die in mehrere Röhrchen aufgeteilt und erneut zentrifugiert wird. Proben werden dann bei -112 Grad Fahrenheit für die spätere Analyse aufbewahrt.

Reinigung des Maltose-Bindungsprotein-Fusion-Tags

Affinitäts-Tags sind gentechnisch veränderte Moleküle, die in der Molekularbiologie verwendet werden, um Proteine zu detektieren und zu reinigen. Dieses Protokoll ist ein komplexer Satz von Verfahren, die in drei Stufen unterteilt sind, darunter der Bau eines polyhistidinischen Protein-Markers (HisMBP); ein Pilotexperiment zur Bewertung der Löslichkeit des Proteins; und die großschalige Reinigung von MBP-Molekülen, so Nature Protocols. Abgesehen von E.coli-Proben verwenden Techniker Ampicillin, Kanamycin, IPTG, Anhydrotetracyclin, Glucosemonohydrat, Zelllysepuffer, DNA-Polymerase, PCR-Primer, Tris-Acetat-EDTA und Ethidiumbromid.