Western-Blotting-Protokolle: Ein umfassender Leitfaden für genaue Proteinanalyse

Western-Blotting-Protokolle für genaue Proteinanalyse

Western Blots sind eine Art Proteinblot, die täglich im medizinischen Bereich, in Biologielaboren und anderen wissenschaftlichen Disziplinen verwendet werden. Western Blots, wenn ordnungsgemäß durchgeführt, sind eine Möglichkeit, die Proteinausdruck in Gewebeproben zu untersuchen. Da es Unterschiede in den Parametern jeder Probe geben kann, sollten eine Reihe von Protokollen befolgt werden, um genaue Ergebnisse zu erzielen.

Waschen durchführen

Nach dem Inkubieren der Membranen in den Antikörperlösungen für die entsprechende Zeit, die je nach verwendeter Antikörperlösung variiert, gibt EnCor Biotechnology an, dass die Membran drei Waschvorgänge bei Raumtemperatur in TBS durchlaufen sollte. TBS ist eine Lösung, die eine bestimmte Zusammensetzung und einen bestimmten pH-Wert zum Waschen hat. Die Membran sollte zwischen jeder Einführung einer neuen Antikörperlösung gewaschen werden.

Färbemischung vorbereiten

Laut WesternBlotting.org wird die beste Leistung erzielt, wenn die Färbemischung unmittelbar vor dem Auftragen auf die Membran zubereitet wird. Es gibt mehrere Arten von Färbelösungen, von denen einige gekauft und einige im Labor gemischt werden müssen. Chemilumineszenz-Färbung, laut EnCor Biotechnology, liefert die meisten Informationen pro Färbung, ist aber auch die teuerste und erfordert ein Dunkelkammer zur Entwicklung. Horse Radish Peroxidase Färbung und Alkalische Phosphatase Blotting sind andere Optionen für die Färbung. Unabhängig von der verwendeten Methode ist die Zubereitung der Mischung unmittelbar vor dem Gebrauch unerlässlich.

Puffer verwenden

Nach dem Auftragen der ausgewählten Färbelösung ist die Verwendung eines Puffers entscheidend. Bei der Chemilumineszenz-Färbung ist das Auftragen von Acetat über der Färbelösung Protokoll, laut WesternBlotting.org. Horse Radish Peroxidase Färbung erfordert die Verwendung eines Ammoniumacetatpuffers, um das braune Färbeergebnis zu erzielen. Der Puffer, der bei der Alkalischen Phosphatase Blotting verwendet wird, der ein violettes Färbeergebnis erzeugen sollte, ist komplizierter herzustellen und kann bereits fertig gekauft werden.