Western Blot: Ein umfassender Leitfaden zur Proteinidentifizierung
Die Western-Blot-Analyse ist eine bekannte Technik zur Identifizierung spezifischer Proteine, die aus Gewebe isoliert wurden. Die verschiedenen Proteine werden zuerst nach Ladung und Gewicht auf SDS-Polyacrylamid-Gel getrennt und auf eine Nitrozellulose-Membran übertragen. Nach der Übertragung binden beschriftete Antikörper spezifisch an das gewünschte Protein und werden mittels Röntgenfilm fotografiert oder durch proteinspezifische Färbung visualisiert. Das Endergebnis zeigt dunkle Bänder, die auf das Vorhandensein des identifizierten Proteins hinweisen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die grundlegende Methodik zur Durchführung einer Western-Blot-Analyse in einem für komplexe Protein-Forschung qualifizierten Labor.
Dinge, die Sie benötigen
- SDS-Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE) mit getrennten Proteinen
- Nitrozellulose-Membran
- Destilliertes Wasser
- Transferpuffer (30 g Tris, 144 g Glycin und 200 ml Methanol in 1 l Wasser)
- Filterpapier, Whatman 3 mm
- Labor-Schwamm
- Western-Blot-Transferkammer
- Labor-Netzgerät
- Labor-Kühlschrank
- Labor-Schüttler
- Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) (24,2 g Tris-Basis, 80 g NaCl in 1 l Wasser)
- Blockierlösung (5 Prozent entfettete Milchpulver in TBS)
- Primär-Antikörper-Lösung
- Beschriftete Antikörper-Konjugatlösung
- Alkalische Phosphatase-Substratlösung mit Nitroblau-Tetrazolium-Färbung
- Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)
- Gel-Imager-Box
Anweisungen
- Proteine auf Nitrozellulose-Membran übertragen: Bereiten Sie die Nitrozellulose-Membran vor. Die Membran sollte zwei Minuten in destilliertem Wasser eingeweicht werden, dann in den Transferpuffer gelegt und fünf Minuten eingeweicht werden.
- Transfer-Sandwich zusammenstellen: Stellen Sie ein Transfer-Sandwich aus Schwamm/Filterpapier/SDS-PAGE/Nitrozellulose-Membran/Filterpapier/Schwamm zusammen. Das Sandwich wird so ausgerichtet, dass die Membran näher an der Anode und das Gel näher an der Kathode innerhalb der Transferkammer liegt.
- Transferpuffer hinzufügen: Geben Sie Transferpuffer in die Kammer, sodass das Sandwich untergetaucht ist. Stellen Sie die Kammer in den Labor-Kühlschrank. Der Transfer von Protein vom Gel auf die Membran sollte bei 4 Grad Celsius durchgeführt werden.
- Netzgerät einrichten: Richten Sie das Netzgerät ein, um Proteine vom Gel auf die Membran zu übertragen. Die Transferrichtung ist zur Anode hin, angezeigt durch die rote Leitung. Größere Proteine bewegen sich schneller als Reaktion auf einen elektrischen Strom und bewegen sich zuerst. Das Netzgerät kontrolliert die Übertragungsrate. Stellen Sie die Leistung auf 30 V und 40 mA für einen Übernachttransfer ein.
- Netzgerät abbauen: Bauen Sie das Netzgerät nach Abschluss des Transfers ab. Berühren Sie den Transferpuffer nicht und entfernen Sie das Sandwich nicht, während das Netzgerät angeschlossen ist.
- Membran inkubieren: Entfernen Sie die Membran aus dem Sandwich und inkubieren Sie sie zwei Stunden in der Blockierlösung. Proteine in der Blockierlösung werden in die Membran absorbiert, wo keine Proteine vorhanden sind. Es verhindert, dass Antikörper an der Membran binden, wo das gewünschte Protein nicht vorhanden ist.
- Antikörper binden: Inkubieren Sie die Nitrozellulose-Membran mit der Primär-Antikörper-Lösung unter Verwendung eines Schüttlers. Die Membran muss mindestens eine Stunde lang vollständig in der Lösung untergetaucht sein. Ein Übernachtinkubieren ist akzeptabel.
- Membran waschen: Waschen Sie die Membran gründlich, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Vier separate 10-minütige Wäschen mit TBS reichen in der Regel aus, um überschüssige Antikörper zu entfernen.
- Membran mit beschriftetem Antikörper-Konjugat inkubieren: Inkubieren Sie die Membran mit der beschrifteten Antikörper-Konjugatlösung unter Verwendung des Schüttlers. Die Membran muss mindestens eine Stunde inkubiert werden. Das beschriftete Antikörper-Konjugat ist an alkalische Phosphatase gebunden. Es ist die Enzym-Antikörper-Mischung, die den ersten Antikörper erkennen und binden wird.
- Protein nachweisen: Spülen Sie die Membran viermal für 10 Minuten in PBS. Dies entfernt den Rest des beschrifteten Antikörper-Konjugats.
- Membran in Substratlösung inkubieren: Inkubieren Sie die Membran in der alkalischen Phosphatase-Substratlösung, bis Bandmuster erscheinen. Der Farbstoff in der Substratlösung wird an das Antikörper-Antigen-Protein in der Membran binden und ein dunkel gefärbtes Band bilden. Der Prozess kann sofort sein oder bis zu 30 Minuten erfordern, bevor die Bänder beobachtet werden.
- Membran verpacken und visualisieren: Wickeln Sie die Membran vollständig in Zellophan ein und legen Sie sie direkt auf den Gel-Imager, um die Ergebnisse zu visualisieren. Der Gel-Imager ist in der Lage, die auf der Western-Blot-Membran angezeigten Ergebnisse zu fotografieren.
