DNA-Analysetechniken: Ein historischer Überblick (seit 1985)

Genetikbasierte Forschung ist heute eines der sich am schnellsten entwickelnden wissenschaftlichen Disziplinen. Frühe Technologie begann mit Techniken unter Verwendung radioaktiver Markierungen für die DNA-Sequenzierung, Identifizierung einzelner Basen, die DNA ausmachen. DNA ist der Bauplan für jeden lebenden Organismus, einschließlich Viren. Sie besteht aus Millionen oder Milliarden sich wiederholender Einheiten von vier stickstoffhaltigen Basen, bezeichnet als A für Adenosin, G für Guanosin, C für Cytosin und T für Thymin. Menschen enthalten etwa 9 Milliarden dieser Basen, die sich ohne ein auffälliges Muster wiederholen. Drei Basen zusammen symbolisieren eine Aminosäure. Eine Kette von Aminosäuren bestimmt ein Protein. Die Ergänzung verschiedener Proteine bestimmt die Merkmale eines lebenden Organismus, genannt Phänotyp. DNA-Analysetechniken werden verwendet, um DNA-Sequenzen zu bestimmen, um zu verstehen, wie sich lebende Organismen entwickeln, und um die Fehler in der Sequenz zu erkennen, die Krankheiten wie Krebs verursachen. Die Technologie entwickelte sich rasch nach der Entwicklung der PCR im Jahr 1985.

Polymerase-Kettenreaktion

• Die Polymerase-Kettenreaktion, oder PCR, ist vielleicht der wichtigste wissenschaftliche Durchbruch in der Genetikforschung. Kary Mullins erfand die PCR im Jahr 1985. Der PCR-Prozess ermöglicht es Wissenschaftlern, bestimmte Bereiche der DNA zu vervielfältigen und innerhalb von Stunden Millionen von Kopien zu produzieren. PCR verwendet ein hitzestabiles Enzym namens TAQ-Polymerase, das aus einer Bakterienart namens Thermus aquaticus isoliert wurde, die in heißen Quellen vorkommt. In Gegenwart von Rohstoffen synthetisiert die TAQ-Polymerase doppelte Kopien der DNA unter Verwendung der ursprünglichen DNA als Vorlage. Forscher können den genauen Bereich der DNA bestimmen, der vervielfältigt werden soll, indem sie 20-Basen-Stränge der DNA einschließen, die Primer genannt werden. Primer initiieren die Verstärkung, indem sie sich an eine passende Gruppe von Basen auf der DNA-Vorlage paaren oder anlagern. Alle seit 1985 entwickelten neuen Technologien erfordern eine Derivat der PCR-Verstärkung.

DNA-Sequenzierungstechniken

• Die DNA-Sequenzierung bestimmt die genaue Reihenfolge der stickstoffhaltigen Basen. Bei der frühen Entwicklung von Sequenziermethoden wurde jede Base während der PCR mit einem radioaktiven Etikett markiert. Die amplifizierte DNA würde durch einen elektrischen Strom getrennt und durch ein gelartiges Material namens Polyacrylamid wandern. Die Technologie war dadurch begrenzt, dass jede Basezusammensetzung in separaten Spuren bestimmt wurde, da radioaktive Etiketten auf Röntgenfotos gleich aussehen. Für jede Base wurde eine Spur auf dem Gel verwendet. Die Entwicklung von fluoreszenden Farbstoffen automatisierte die Technologie Anfang der 1990er Jahre, und jede Base wurde mit einer anderen Farbe markiert. Während die Basen durch das Gel wanderten, zeichnete eine Digitalkamera die Farben auf und sendete die Daten an ein angeschlossenes Computersystem. Automatisierte Sequenzierung erlaubte es, bis zu 700 Basen zu bestimmen, gegenüber der 200-Base-Beschränkung für radioaktive Etiketten.

Entwicklung der Kapillarsequenzierung

• Um 1997 wurden DNA-Sequenzierungstechniken weiterentwickelt, indem unordentliche Glasplatten und Polyacrylamid durch Glas-Kapillaren ersetzt wurden. Forscher mussten nicht länger Acrylamid zwischen zwei Glasplatten gießen und auf die Bildung von gelartigem Polyacrylamid warten, bevor sie sequenzierten. Die Sequenzierung wurde stattdessen mit einem dicken, sirupartigen Polyacrylamid-Derivat durchgeführt, das mit einer Spritze in hohle Glasfasern eingespritzt wurde. Proben werden immer noch mit PCR und fluoreszenden Farbstoffen amplifiziert und dann automatisch in einzelne Kapillaren zur Sequenzierung geladen. Das Ergebnis war mehr Automatisierung in Techniken und die Kapazität, eine größere Anzahl von Proben in kürzerer Zeit zu sequenzieren. Der Großteil des menschlichen Genoms, alle 9 Milliarden Basen, wurde mit Kapillarsequenzierung bestimmt.

Echtzeit-PCR

• Nachdem die DNA-Sequenz für einen bestimmten Organismus bestimmt wurde, war das nächste Ziel in der Forschung, Variationen zwischen Organismen derselben und verschiedener Arten zu suchen. Ein Grund ist, Unterschiede und Ähnlichkeiten in der DNA-Sequenz verschiedener Arten zu analysieren; warum Menschen Menschen und Gorillas nicht sind. Ein weiterer Grund ist, genetische Techniken zu verwenden, um Fehler oder Mutationen zu bestimmen, die genetische Krankheiten verursachen. Die Echtzeit-PCR verwendet eine Technologie, die der PCR ähnelt und einen zusätzlichen fluoreszenzmarkierten Primer einbezieht, um eine bestimmte Sequenz zu markieren. Jeder Fehler in der DNA verhindert, dass sich der Marker an die DNA-Strang anlagert. Die Fähigkeit des Markers, sich anzulagern, wird während der PCR gemessen, um festzustellen, ob eine Mutation vorliegt.

Mikrochip-Array-Technologie

• Die Mikrochip-Array-Analyse wurde kurz nach der Echtzeit-PCR entwickelt und wird hauptsächlich für die Genexpression verwendet, um zu bestimmen, welche Gene in einer Zelle aktiv sind. Nicht jedes Gen im Genom ist aktiv. Die Aktivierung bestimmter Gene bestimmt die Funktion verschiedener Zelltypen in komplexen Organismen; warum Hautzellen beispielsweise keine Leberzellen sind. Forscher isolieren das Produkt aktiver Gene in Form von Boten-RNA oder mRNA und verwenden PCR-Techniken, um ein DNA-Komplement zu produzieren. Die Beispiel-DNA wird auf einer Platte mit markierten Sonden aufgebracht, die in Gegenwart von DNA fluoreszieren. Die heute verwendeten Platten können gleichzeitig über 30.000 Proben auf einmal testen.

Next-Generation-Sequenzierung

• Die neueste Entwicklung in den DNA-Analysetechnologien sind Next-Generation-Sequenzierer. Der Prozess ist nicht unähnlich der normalen Sequenzierung. Die Ausrüstung ist jedoch in der Lage, gesamte Genomsequenzen zu bestimmen, die aus Bakterien isoliert wurden, 2 Millionen Basen auf einmal. Der Prozess beinhaltet Emulsions-PCR, eine Technik, die DNA verwendet, die auf einer Mikroperle oder einem Öltröpfchen eingekapselt ist. Sie verbessert die Effizienz normaler PCR-Techniken erheblich und erlaubt es, mehrere Bereiche der DNA gleichzeitig zu amplifizieren. Die amplifizierte DNA wird dann mit spezialisierten Next-Generation-Sequenzierern sequenziert. Mit der Entwicklung der in der Genetikforschung verwendeten Technologie ist die Genetik zu einem der sich am schnellsten entwickelnden Bereiche der wissenschaftlichen Forschung geworden.