Prinzip
Kaseinhydrolyse → ↓ Trübung (Klärung) + ↑ lösliche Peptide/Aminosäuren. Absorption bei 280 nm (aromatische AAs) oder 440 nm (Farbtest mit TCA/Folin) steigt, während Peptide anreichern. Objektiver als visuelle Klärung.
Optimiertes Protokoll
Materialien
- Trypsin-Lösung (z. B. 0,1 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM CaCl₂)
- Kasein-Substrat (1 % w/v im gleichen Puffer; oder Azocasein für Farbtest)
- Stopp-Lösung: 10 % TCA oder 0,5 M NaOH (denaturiert Trypsin)
- Spektrophotometer + Quarz-Küvetten (1 cm Lichtweg)
- Wasserbad (37 °C)
Prozedur
- Substrat und Enzym separat vorwärmen (37 °C, 5 Min.).
- Reaktion starten: 1 mL Kasein + 0,1 mL Trypsin mischen (End-[E] definiert). Timer starten.
- In Intervallen (0, 1, 2, 5, 10, 20, 30 Min.) 0,2 mL Aliquot entnehmen → 0,8 mL Stopp-Lösung. Wirbeln.
- Zentrifugieren 10.000g × 5 Min. (ausgefallenes Protein entfernen).
- Überstand A₂₈₀ (Peptidbindungen) messen oder Folin-Lowry/BCA am Überstand für Gesamtpeptide-Quantifizierung durchführen.
- A₂₈₀ (oder µg Peptid/mL) gegen Zeit auftragen.
Endpunktbestimmung
- Initialrate-Methode (bevorzugt): Lineare Regression früher Zeitpunkte (0–10 % Hydrolyse) → V₀ (ΔA/Min). Vermeidet Endpunktmehrdeutigkeit.
- Plateau-Methode: Zeitpunkt, wenn ΔA/Δt <5 % der Initialrate (Reaktion nahe abgeschlossen).
- Fixierter Zeit-Assay: A zu definiertem Zeitpunkt (z. B. 10 Min.) mit Standardkurve (Kaseinhydrolysat) vergleichen.
Vorteile gegenüber visueller Klärung
- Quantitativ, reproduzierbar, kinetische Daten (Kₘ, Vₘₐₓ möglich).
- Unempfindlich gegenüber Beobachterverzerrung, Beleuchtung, Partikelgröße.
- Erkennt frühe Hydrolyse vor sichtbarer Klärung.
Häufige Fallstricke
- Kasein-Lot-Variabilität → jedes Assay Standardkurve laufen lassen.
- TCA-Ausfällung unvollständig → Streuung bei 280 nm. 0,22 µm Filter verwenden.
- Trypsin-Autolyse bei 37 °C → Enzym-only-Blank einschließen.
