IHC-Antikörperverdünnung: Umfassender Leitfaden für optimale Ergebnisse

Die Immunhistochemie (IHC) ist eine Spezialtechnik, mit der Wissenschaftler Zellen in Geweben sichtbar machen, die auf einem Objektträger platziert und mit einem geeigneten Antikörper gefärbt wurden, der ein für die Zelle oder das Gewebe spezifisches Protein erkennt. Antikörperverdünnungen (Titrationen) müssen unter den in Ihrem eigenen Protokoll angegebenen experimentellen Bedingungen durchgeführt werden, nicht unter denen des Antikörperherstellers, da diese nicht identisch sein können.

Benötigte Materialien

• Zu färbende Zellen
• Antikörper
• Verdünnungspuffer („Verdünnungsmittel“)
• Pipetten und Spitzen
• Mikrozentrifugenröhrchen
• Alufolie
• Laborstifte und Röhrchenetiketten
• Eis
• lichtgeschützte Objektträgerbox

Anleitung

1. Überprüfen und vorbereiten Sie den Antikörper. Vergewissern Sie sich, dass der Antikörper im richtigen Wirtstier hergestellt wurde und mit der exakten Proteinversion (bekannt als Isoform oder Splice-Variante) reagiert, die getestet wird. Entnehmen Sie mit einer Pipette vorsichtig einen Anteil von 10 Mikrolitern und kennzeichnen Sie diesen als „persönlicher Vorrat“.

   Wenn nur sehr geringe Antikörpermengen verfügbar sind, überspringen Sie diesen Schritt.

   Die Aufbewahrung eines persönlichen Vorrats ist in allen Laboren Standardpraxis, um eine Kreuzkontamination des Originalvorrats zu verhindern. Füllen Sie diesen in ein lichtgeschütztes Mikrozentrifugenröhrchen oder ein normales Mikrozentrifugenröhrchen, das in Alufolie eingewickelt ist, um es vor direktem Licht zu schützen.

   Bewahren Sie dieses Röhrchen auf Eis auf, möglichst in einer Kühlbox mit luftdichtem Deckel, erneut um Licht zu minimieren, das den Antikörper zerstören kann. Notieren Sie die Konzentration des Originalvorrats (z. B. 100 Einheiten pro Milliliter, 1 Milligramm pro Mikroliter usw.) auf dem Röhrchen, einschließlich des Antikörpernamens und des Puffers, in dem er verdünnt ist (z. B. Serum, Kochsalzlösung oder Wasser usw.).

2. Bereiten Sie den Verdünnungspuffer vor, auch Antikörperverdünnungsmittel genannt. Prüfen Sie, ob dieser mit dem Antikörper und dem verwendeten IHC-Verfahren kompatibel ist, zum Beispiel darf er keine Fluoreszenz verdecken oder eine anschließende Sekundärantikörpermarkierung hemmen. Stellen Sie einen Standard-IHC-Verdünnungspuffer (ebenfalls Blockierpuffer) her, indem Sie 1x phosphatregeinigte Kochsalzlösung mit 1 % Triton-X100, 10 % fetaler Kalbsserum und 0,2 % Natriumazid mischen.

3. Titrieren Sie den Antikörper. Ermitteln Sie bei der gegebenen Konzentration des Antikörpers im persönlichen Vorrat (ausgedrückt in Konzentrationseinheiten wie Mikrogramm pro Mikroliter) das Volumen des Antikörpers, das benötigt wird, um 10 Mikrogramm Antikörper zu erhalten.

   Richten Sie eine Verdünnungsreihe ein, indem Sie ein Volumen pipettieren, das 2 Mikrogramm Antikörper entspricht (z. B. X Mikroliter), in 100 Mikroliter Verdünnungsmittel und mischen Sie gründlich durch Auf- und Abpipettieren. Nehmen Sie von dieser Ausgangsverdünnung dieselben X Mikroliter und geben Sie diese in weitere 100 Mikroliter Verdünnungsmittel. Wiederholen Sie dies, bis 8–10 Verdünnungen (oder eine Reihe) hergestellt sind.

   Das letzte Röhrchen hat daher die niedrigste Konzentration und stellt die „sättigende“ Konzentration dar, die während des Experiments das höchste Signalniveau erzeugt. Die ideale Konzentration liegt jedoch etwas höher, damit nicht zu viel Signal entsteht, was Hintergrundfehler verursachen kann.

   Beschriften Sie die Röhrchen korrekt mit den neuen verdünnten Konzentrationen.