Wie für Nucleic Acids Test

Testen für Nukleinsäuren wird in der medizinischen Diagnostik , um Pathogene , wie Viren oder Bakterien zu detektieren geführt . Diese Tests sind viel schneller und damit ermöglichen, einen Arzt , die Behandlung für einen Patienten, der normalerweise hätte zur Bestätigung der Infektion mit mehr langwierig und mühsam Antikörper-basierte Assays warten starten. Das Verfahren wird auch als Nukleinsäure-Amplifikation Test bekannt und umfaßt ein Verfahren, wie "Reverse- Transkriptase- Verstärkung" bekannt durch Polymerase- Kettenreaktion . Da es sich um eine hoch spezialisierte wissenschaftliche Verfahren , erweiterte Kenntnisse und Erfahrungen in molekularbiologischen Techniken und Theorie benötigt wird. Was Sie
PCR-Röhrchen Brauchen
PCR-Cycler
Pipetten -und Filterspitzen
Handschuhe
Cells
Trizol oder andere RNA-Extraktion Reagenz
PCR-Puffer
Taq-Polymerase
RT- PCR-Primer bei 1 mg /ml Konzentration
RNase-freies Wasser
dNTPs
MgCl2
Zufalls Primer bei 1,8 mg /ml Konzentration
Superscript II Reverse Transkriptase
< br > Mehr zeigen Anleitung
Verarbeitung und Herstellung von RNA
1

Ernte- Zellen mit einer RNA-Extraktion Reagenz, wie Trizol . 1 ml, ausreichend ist, um Zellen von einem Well einer Sechs-Well- Gewebekulturplatte zu sammeln. Die Zellen werden gründlich auf und ab pipettiert , um sie zu homogenisieren und führen Sie dann die Extraktionsverfahren , wie in der Trizol Datenblatt beschrieben . Kurz gesagt, extrahiert mit Chloroform, dann Zentrifuge , um die Phasen von DNA , RNA und Protein zu trennen. Recover nur die farblose RNA -Phase und Niederschlag, der mit Isopropanol . Nach der Inkubation , Zentrifugen und aufräumen , dass die resultierende Pellet mit Ethanol mehrere Wäschen. Dann das Pellet in RNase-freiem Wasser.
2

reverse Transkription , denaturieren genau 5 Mikrogramm RNA bei 65 Grad Celsius in einem 10 Mikroliter (ul ) Volumen RNase -freies Wasser , dann schnell auf Eis legen . Für jede Reaktion Mähdrescher 10 ul RNA , 3 ul 10x PCR- Reaktionspuffer , 2,5 &mgr; l 10 mM dNTP , 6 l 25 mM Magnesiumchlorid, 1 ul Zufallsprimer von 1,8 Milligramm pro Milliliter Konzentration und 0,5 ul Superscript II -Reverse-Transkriptase -Enzym. Füllen Sie jede Reaktion mit 17 ul RNase-freies Wasser. Die Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert und dann bei 42 Grad Celsius für eine Stunde , um die cDNA zu produzieren , dann denaturieren bei 95 Grad Celsius und schnell Eis, um die Reaktion zu stoppen .
3

für eine Polymerase- Kettenreaktion , wieder eine Reaktionsmischung in 0,5 ml-Röhrchen durch Kombinieren 6 ul cDNA in der reversen Transkriptionsreaktion , 1,5 ul 10X PCR -Reaktionspuffer , 0,2 ul Taq -Polymerase , 0,5 Mikroliter Reverse-Primer hergestellt und eingestellt von vorwärts-Primer , dann von oben bis jedes Rohr mit 10,3 ul RNase-freies Wasser. 95 Grad Celsius für 0,5 Minuten denaturiert , gefolgt von 60 Grad Celsius für 45 Sekunden, um Glühen und schließlich 72 Grad : Um die Reaktionen , ein Thermocycler (dh eine Maschine, die Polymerase-Kettenreaktionen führt ) für 30 Zyklen wie folgt ausgeführt Celsius für 1 Minuten , um das synthetisierte Transkript verlängern.