Nukleinsäuretest: Schnelle Detektion für schnellere Diagnose

Nukleinsäuretest

Die Testung auf Nukleinsäuren wird in der medizinischen Diagnostik durchgeführt, um Krankheitserreger wie Viren oder Bakterien zu erkennen. Diese Tests sind viel schneller und ermöglichen es einem Arzt daher, die Behandlung für einen Patienten zu beginnen, der sonst auf die Bestätigung einer Infektion mit längeren und mühsameren Antikörper-basierten Assays hätte warten müssen. Der Prozess wird auch als Nukleinsäure-Amplifikationstest bezeichnet und umfasst eine Methode, die als „Reverse-Transkriptase-Amplifikation“ mittels Polymerase-Kettenreaktion bekannt ist. Da dies ein hochspezialisiertes wissenschaftliches Verfahren ist, sind fortgeschrittene Kenntnisse und Expertise in molekularbiologischen Techniken und Theorie erforderlich.

Benötigte Materialien

• PCR-Röhrchen
• PCR-Cycler
• Pipetten und Filterspitzen
• Handschuhe
• Zellen
• Trizol oder anderes RNA-Extraktionsreagenz
• PCR-Puffer
• Taq-Polymerase
• RT-PCR-Primer bei 1 mg/ml Konzentration
• RNase-freies Wasser
• dNTPs
• MgCl2
• Zufalls-Primer bei 1,8 mg/ml Konzentration
• SuperScript II Reverse-Transkriptase

Anweisungen

1. Verarbeitung und Vorbereitung von RNA

   Ernten Sie Zellen mit einem RNA-Extraktionsreagenz wie Trizol. 1 ml reicht aus, um Zellen aus einem Brunnen einer Sechsbrunnen-Zellkulturplatte zu sammeln. Die Zellen werden gründlich auf- und abpipettiert, um sie zu homogenisieren, und dann wird das Extraktionsverfahren wie im Trizol-Datenblatt beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, extrahieren Sie mit Chloroform, zentrifugieren Sie dann, um die Phasen von DNA, Protein und RNA zu trennen. Gewinnen Sie nur die farblose RNA-Phase und fällen Sie diese mit Isopropanol aus. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie dies und reinigen das resultierende Pellet mit mehreren Ethanol-Wäschen. Suspendieren Sie dann das Pellet in RNase-freiem Wasser.

2. Für die Reverse-Transkription denaturieren Sie genau 5 Mikrogramm RNA bei 65 Grad Celsius in einem Volumen von 10 Mikrolitern (µl) RNase-freiem Wasser und legen sie dann schnell auf Eis. Für jede Reaktion mischen Sie 10 µl RNA, 3 µl 10x PCR-Reaktionspuffer, 2,5 µl 10 Millimolar dNTP, 6 µl 25 Millimolar Magnesiumchlorid, 1 µl Zufalls-Primer von 1,8 Milligramm pro Milliliter Konzentration und 0,5 µl SuperScript II Reverse-Transkriptase-Enzym. Füllen Sie jede Reaktion mit 17 µl RNase-freiem Wasser auf. Inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur für zehn Minuten und dann bei 42 Grad Celsius für eine Stunde, um die cDNA zu produzieren, und denaturieren Sie dann bei 95 Grad Celsius und legen sie schnell auf Eis, um die Reaktion zu stoppen.

3. Für eine Polymerase-Kettenreaktion stellen Sie erneut eine Reaktionsmischung in 0,5 ml Röhrchen her, indem Sie 6 µl cDNA, die in der Reverse-Transkriptionsreaktion hergestellt wurde, 1,5 µl 10x PCR-Reaktionspuffer, 0,2 Mikroliter Taq-Polymerase, 0,5 Mikroliter Reverse-Primer und ebenfalls 0,5 Mikroliter Forward-Primer kombinieren, und füllen Sie jedes Röhrchen dann mit 10,3 µl RNase-freiem Wasser auf. Um die Reaktionen durchzuführen, stellen Sie einen Thermocycler (eine Maschine, die Polymerase-Kettenreaktionen durchführt) für 30 Zyklen wie folgt ein: 95 Grad Celsius für 0,5 Minute zur Denaturierung, gefolgt von 60 Grad Celsius für 45 Sekunden zum Anlassen und schließlich 72 Grad Celsius für 1 Minute zur Verlängerung des synthetisierten Transkripts.