Zellbasiertes ELISA-Protokoll: Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung

Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist eine Eckpfeiler-Technik in der klinischen Diagnostik und biologischen Forschung zur Quantifizierung spezifischer Proteine. Durch die Nutzung der Spezifität von Antikörpern und einer kolorimetrischen oder chemilumineszenten Auslesung übersetzt ELISA Proteinreichtum in ein messbares Signal.

Zellkultur

Säen Sie Zellen in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte bei einer Dichte, die 100 µL Wachstumsmedium pro Vertiefung ergibt. Lassen Sie die Zellen über Nacht anhaften. Bei Studien mit zellulären Reaktionen auf externe Reize, serumstarren Sie die Zellen 24 Stunden vor dem Hinzufügen des Faktors von Interesse.

Fixierung und Primärantikörper

Entfernen Sie das Medium und fixieren Sie die Zellen mit 3 % Formaldehyd oder Methanol. Um den Antikörperzugang zu ermöglichen, durchlässig machen Sie die Membran mit 0,1 % Triton X-100, sofern die Methanol-Fixierung nicht bereits durchgeführt wurde. Blockieren Sie unspezifische Stellen mit 10 % fetalen Kälberserum, verdünnt in gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Nach dem Blockieren fügen Sie den Primärantikörper hinzu und inkubieren 60 Minuten bei Raumtemperatur.

Sekundärantikörper und Detektion

Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, wenden Sie dann einen Sekundärantikörper an, der mit Horseradishperoxidase (HRP) konjugiert ist. Inkubieren Sie 60 Minuten, waschen Sie erneut und fügen Sie ein chemilumineszenten Substrat hinzu. Erfassen Sie das emittierte Licht mit einem Plattenlesegerät oder Bildgebungssystem, um Proteinspiegel zu quantifizieren.