Intrazelluläre Färbung für die Durchflusszytometrie: Ein Protokoll

Die Durchflusszytometrie ist ein Werkzeug, das bei der Untersuchung von Zellproteinen nützlich ist. Sie nutzt die Emission von Licht oder Fluoreszenz von den Proteinen innerhalb der Zelle. Antikörper oder Sonden, die mit Fluoreszenz markiert sind, werden verwendet, um spezifische Proteine zu untersuchen. Die Durchflusszytometrie wird zur Diagnose einer Reihe von Krankheiten verwendet, einschließlich Krebs, ist aber auch in der medizinischen Forschung nützlich.

Zellen fixieren

Zellen sollten fixiert werden, um die Stabilität der intrazellulären Proteine zu erhalten. Eine Reihe von Fixativien kann verwendet werden, wie Formaldehyd oder eiskaltes Aceton. Nach der Fixierung muss die Zellmembran durchlässig gemacht werden, um den Antikörper in die Zelle eintreten zu lassen. Detergentien wie Triton oder NP-40 oder eiskaltes Methanol können verwendet werden, um Löcher in die Zellmembran zu machen.

Färbung

Zellen im Blockierungspuffer 0,5 Prozent bovines Serumalbumin, verdünnt in gepufferter Kochsalzlösung (BSA/PBS), waschen. Zellen werden im Blockierungspuffer inkubiert, um unspezifische Bindung zu reduzieren. Primärantikörper, verdünnt in Blockierungspuffer, hinzufügen und bei Raumtemperatur für die optimierte Zeitdauer inkubieren lassen. Mit Blockierungspuffer waschen.

Analyse

Den Sekundärantikörper, der mit einem fluoreszenden Tag markiert ist, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Um ungebundenen Antikörper zu entfernen, Zellen im Blockierungspuffer waschen. Zellen zu einem Pellet zentrifugieren und dann in PBS resuspendieren und im Durchflusszytometer analysieren.