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Durchflusszytometrie: Prinzipien, Anwendungen und Datenanalyse

Durchflusszytometrie misst gleichzeitig mehrere physikalische und fluoreszente Parameter einzelner Zellen in Suspension mit hohem Durchsatz (10.000–50.000 Ereignisse/Sekunde).

Kernprinzipien

Hydrodynamische Fokussierung: Probenkern zentriert in Scheidenflüssigkeit → Einzelzell-Interrogation.
Lichtstreuung: FSC (Vorwärtsstreu ≈ Größe), SSC (Seitenstreu ≈ Körnigkeit/Komplexität).
Fluoreszenz: Fluorochrom-konjugierte Antikörper binden Zielantigene; Laser anregen; Detektoren erfassen Emission (Bandpass-Filter).
Kompensation: Spektralüberlappungskorrektur zwischen Fluorochromen.
Gating: Sequenzielle Plots isolieren Populationen von Interesse (z. B. Lymphozyten → Singlets → CD3+ → CD4/CD8).

Wichtige Anwendungen

Feld	Verwendungen
Immunphänotypisierung	Lymphozyten-Subpopulationen (T/B/NK), Aktivierungsmarker, Tregs, Erschöpfung (PD-1, TIM-3)
Hämatologische Malignome	Leukämie/Lymphom-Diagnose (CD-Marker), MRD (10⁻⁴–10⁻⁶), Linieneinteilung
Zellzyklus/Proliferation	Ki-67, DAPI/PI, BrdU/EdU – S/G2/M-Fraktion
Apoptose	Annexin V / 7-AAD oder PI – frühe/späte Apoptose
Funktionell	Zytokin-Erfassung (ICS), Phospho-Flow (pSTAT, pERK), Kalzium-Fluss, ROS, mitochondriales Potenzial
Zellsortierung (FACS)	Hohe Reinheits-Isolierung für Genomik, Kultur, Transplantation

Moderne Fortschritte

Spektrale Zytometrie (40+ Parameter, Autofluoreszenz-Entmischung)
Massenzytometrie (CyTOF) – metall-markierte Antikörper, 40+ Parameter, keine Spektralüberlappung
Bildgebende Durchflusszytometrie (Morphologie + Fluoreszenz)
Einzelzell-Multiomik (CITE-seq, REAP-seq: Oberflächenprotein + Transkriptom)

Qualitätskontrolle

Tägliche QC-Perlen (Ausrichtung, Sensitivität, Fluoreszenzstabilität)
Standardisierung: EuroFlow, ICCS, CYTOF-Panels.
Biosicherheit: BSL-2 für nicht fixierte menschliche Proben; Fixierung für Versand.

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