FRET-Testanleitung: Prinzipien, Anwendungen & Protokoll

Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) ist eine Testtechnik, die verwendet wird, um das Vorhandensein und die Menge der Bindung zwischen zwei markierten Proteinen zu messen. Dieser Test wird häufig verwendet, um potenziell bindende Proteine in verschiedenen Zelltypen zu analysieren und die Wirksamkeit von Konjugations-Enzymen zu messen. Die benötigte Detektionsausrüstung hängt weitgehend von den Arten der verwendeten Reporter-Moleküle ab, obwohl in vielen Fällen ein einfacher 96-Well-Plattenleser verwendet werden kann.

Benötigte Utensilien

• Protein-of-interest/Reporter-Molekül-Konstrukte für jedes zu testende Protein
• 96-Well-Plattenblock
• 96-Well-Plattenleser
• Reaktionspuffer (im Allgemeinen auf Tris- oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung basierend)
• Konjugations-Enzym (falls erforderlich)

Anleitung

1. Fusionskonstrukte für jedes Protein of Interest generieren oder vorbereiten, wobei jedes mit einem Fluoreszenzübertragungsmolekül wie grünem fluoreszierenden Protein (GFP), Rhodamin oder Bor-Dipyrromethen (BODIPY) verknüpft ist.

2. Absorptions- und Emissionswellenlängen jeder fluoreszierenden Komponente und des gesamten Tests bestimmen. (Wenn der Test beispielsweise GFP–>Rhodamin-Fluoreszenzenergietransfer misst, ist die Eingabe-Absorptionswellenlänge die von GFPs Absorption (488 nm), und die Emissionserkennungswellenlänge ist die für Rhodamin (595 nm)).

3. Den geeigneten Reaktionspuffer für das Experiment erstellen, abhängig von den biochemischen Eigenschaften der Proteine of Interest. Ein TRIS-basierter Puffer wird häufig verwendet, einschließlich Calciumchlorid und 0,05 Prozent Tween-20. Spezifische Konzentrationen und Komponenten können bestimmt werden, indem nach Zeitschrifteneinträgen gesucht wird, die ähnliche Reaktionen und Bedingungen beschreiben.

4. Die beiden Reporter-konjugierten Proteine of Interest in verschiedenen Konzentrationen im Reaktionspuffer mischen und 50–200 µl pro Well aliquotieren. Ein Konjugations-Enzym (z. B. Sortase) zu jeder Sample-Well hinzufügen, falls angebracht. Wenn ein Endpunkt-Test durchgeführt wird, die Inkubation bei Raumtemperatur (oder der optimalen Temperatur des Enzyms) für einen bestimmten Zeitraum zulassen, dann auf dem 96-Well-Plattenleser auslesen. Wenn ein Kinetik-Test durchgeführt wird, direkt mit dem Auslesen fortfahren.

5. Die Sample-Platte in den 96-Well-Plattenleser einlegen. Eine neue Experimentseite erstellen und das Einstellungsmenü aufrufen. Die korrekten Absorptions-(Anregungs-) und Emissionswellenlängen eingeben, dann die auszulesenden Wells auswählen. Wenn ein Kinetik-Experiment durchgeführt wird, den Zeitverlauf des Experiments und das Ausleseintervall festlegen (z. B. einmal alle 10 Minuten). Mit dem Auslesen der Sample beginnen. Daten mit der Diagrammfunktion von Microsoft Excel (oder einem anderen Diagrammprogramm wie GraphPad) analysieren.