Fehlerbehebung bei der Drei-Fragment-Ligation: Ein umfassender Leitfaden

Ligation ist eine Methode, die in der biologischen Forschung verwendet wird, um separate DNA-Stränge zu verbinden. Der Prozess wurde mithilfe kommerziell erhältlicher Ligation-Kits vereinfacht. Ein Ligation-Verfahren wird in der Regel von einer Transformation gefolgt, einem Prozess, bei dem die verbundene DNA in einen bakteriellen Vektorempfänger eingefügt wird, um die DNA zu klonen und zu vervielfältigen. Aufgrund der Komplexität der Methode entsprechen die Ergebnisse oft nicht dem gewünschten Produkt und erfordern Fehlerbehebung. Dies ist vorherrschender bei dem Versuch, mehrere Fragmente zu verbinden, wie bei einer Dreifach-Ligation.

Was Sie benötigen

• Ligation-Kit
• Ligation-Protokoll
• Agarosegel
• 50 X TBA-Puffer (242 g Tris-Basis, 57,1 ml Eisessig, 100 ml 0,5 M EDTA, auf 1 Liter mit Wasser verdünnt)
• Desionisiertes Wasser
• DNA-Reinigungskit

Anleitung

1. Fehlerbehebung bei der Transformation

   Erstellen Sie eine Liste der Schritte, die an der Ligation und Transformation beteiligt sind. Die Fehlerbehebung bei jedem wissenschaftlichen Protokoll beginnt in der Regel mit dem letzten Schritt und arbeitet rückwärts.

   Vergleichen Sie das gereinigte DNA-Produkt der Probe mit der Kontroll-DNA, die mit dem Kit geliefert wird. Sobald DNA in Bakterien transformiert und geklont wurde, kann sie isoliert, gereinigt und durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft werden. Die Ergebnisse der Elektrophorese würden anzeigen, ob die Transformation erfolgreich war.

   Bestimmen Sie das Bakterienwachstum während des Klonens. Die meisten bakteriellen Vektoren sind so konstruiert, dass nur solche mit einem DNA-Einsatz auf einem Medium mit Ampicillin oder einem anderen Antibiotikum wachsen. Ein schlechtes Wachstum könnte darauf hindeuten, dass die DNA-Probe nicht erfolgreich in den Vektor eingefügt wurde.

   Bestätigen Sie, dass die ligierte DNA-Probe vor der Transformation gereinigt wurde. Puffer-Salze und Ligation-Enzyme könnten die Transformation der eingefügten DNA hemmen. Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass das Ligation-Enzyme durch Hitze inaktiviert wurde, nachdem das Ligation-Verfahren abgeschlossen wurde. Aktive Ligase könnte die Transformation möglicherweise beeinträchtigen.

   Überprüfen Sie das Datum der Bakterienkultur, die für die Transformation verwendet wurde. Alte Bakterienzellen verlieren mit der Zeit an Effizienz. Schließlich sind die Bakterienzellen nicht mehr in der Lage zu transformieren und qualitativ hochwertige Klonierung durchzuführen. Sobald der Transformationsprozess diagnostiziert wurde, können Sie mit der Analyse des Ligation-Verfahrens beginnen.

   Fehlerbehebung bei der Ligation

   Bestätigen Sie die Reinheit Ihrer DNA-Probe vor der Ligation. Salzverunreinigungen in der DNA-Probe könnten zu einer schlechten Ligation führen. Die DNA-Probe sollte gereinigt und frei von Salzen und Enzymen sein, bevor sie in einer Ligation verwendet wird.

   Bestätigen Sie, ob die Enden der zu ligierenden DNA-Stränge stumpf oder klebrig sind. Ligation wird verwendet, um separate Stränge mit stumpfen Enden oder klebrigen Enden zu verbinden, nach der Verdauung mit bestimmten Restriktionsenzymen. T4-DNA-Ligase ist das Enzym der Wahl für stumpf endende DNA – sie funktioniert aber auch für DNA mit klebrigen Enden. Andere DNA-Ligasen funktionieren möglicherweise nur für DNA nach einer Restriktionsverdauung, um klebrige Enden zu erzeugen. Es ist wichtig, die richtige Ligase für die getestete DNA zu verwenden.

   Überprüfen Sie die Konzentration der DNA-Proben vor der Ligation. Die Verwendung von DNA mit hoher Konzentration führt oft dazu, dass DNA linear wird. Die Kit-Anweisungen liefern Informationen über die richtige Menge an DNA, die in einer Ligation-Reaktion verwendet werden sollte.

   Ersetzen Sie das Ligase-Enzym durch eine neue Charge. Enzyme sind besonders empfindlich bei Raumtemperatur und wiederholten Gefrier-Tau-Zyklen. Die Ligase könnte nach einer Reihe von Verwendungen beschädigt werden, einfach durch zu häufiges Einfrieren und Auftauen. Einige Kits empfehlen, die Ligase bei der ersten Verwendung in kleinere Portionen aufzuteilen, um die Anzahl der Wiedergefrierungen zu reduzieren.

   Überprüfen Sie das Ligation-Kit. Oft liegt das Problem bei der Ligation darin, ein abgelaufenes Kit zu verwenden oder eines, das mit anderer DNA und Salzen kontaminiert wurde.