Humangenom-Sequenzierung und genetische Forschung: Ein umfassender Überblick

Genetische Forscher haben ihre Kräfte gebündelt, um die gesamte genetische Sequenz, 9 Milliarden Basen, im menschlichen Genom zu bestimmen. Das Genom ist der DNA-Inhalt, der in jeder menschlichen Zelle vorkommt und aus sich wiederholenden stickstoffhaltigen Basen besteht, die als „A“, „G“, „C“ und „T“ bezeichnet werden. Die Genetikforschung sucht weiterhin nach Variationen in verschiedenen menschlichen Genomen sowie verschiedenen Arten für evolutionäre Studien. Medizinische Genetikstudien sind daran interessiert, genetische Abnormalitäten oder genetische Variationen zu lokalisieren, die Krankheiten verursachen könnten. Genotypisierung ist eine Methode zur Bestimmung genetischer Variation, ohne ein ganzes Genom zu sequenzieren. Forscher isolieren kleine Regionen eines Genoms, um nach Größenunterschieden zu suchen, die das Ergebnis unterschiedlicher Anzahlen stickstoffhaltiger Basen sind. Unterschiedliche Basenanzahlen können durch eine genetische Abnormalität verursacht werden, die zu Krankheiten wie Diabetes, Alzheimer und Krebs führt. Die Werkzeuge, die zur Durchführung von Genotypisierungsanwendungen verwendet werden, haben sich entwickelt und weiterentwickelt, um den individuellen Genotyp schnell und genau zu bestimmen.

Die Polymerase-Kettenreaktion

Die Evolution der Gentechnologie geht auf die Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zurück. Diese Methode ermöglicht es Forschern, kleine Regionen eines Genoms innerhalb von Stunden zu vervielfältigen oder Kopien davon herzustellen. Die Region von Interesse wird durch die Zugabe kurzer DNA-Moleküle – Primer, die den Anfang und das Ende der Region von Interesse entsprechen – bestimmt.

PCR ist zu einem unschätzbaren Werkzeug in der genetischen Forschung geworden. Das Vervielfältigensehen derselben Region bei verschiedenen Individuen bietet eine Vergleichsmethode. Die Forensische Identifikation verwendet derzeit 15 separate Regionen zum Vergleich. Eine Region kann bei verschiedenen Personen übereinstimmen. Allerdings sollten keine zwei Personen alle 15 Regionen gemeinsam haben.

Agarose-Gelelektrophorese

PCR ist die Methode zur Vervielfältigung spezifischer Regionen von DNA. Sie bietet jedoch keine Methode, um die tatsächliche Größe der Fragmente zu vergleichen. Produkte der PCR werden nach Größe getrennt, indem ein gelartiges Material namens „Agarose“ verwendet wird. Kleinere Fragmente wandern schneller über Agarose in Reaktion auf einen elektrischen Strom in einem Prozess namens „Agarose-Gelelektrophorese“.

Nach der PCR werden die Fragmente auf das Agarose geladen und wandern entlang des Gels, wenn ein elektrischer Strom angewendet wird. Ethidiumbromid ermöglicht es, Fragmente unter ultraviolettem Licht zu sehen. Agarose-Gelelektrophorese bietet eine Methode für die schnelle Bestimmung einer erfolgreichen PCR und approximiert die Fragmentgröße. Allerdings besteht der Nachteil von Agarose als Werkzeug für die Genotypisierung darin, dass die Fragmente für genaue Ergebnisse wesentlich unterschiedlich in der Größe sein müssen. Agarose bietet kein gutes Medium zum Vergleichen von Fragmenten, die sich um eine einzelne Base unterscheiden.

Automatisierte Sequenzer und genetische Analysatoren

Automatisierte Sequenzer und genetische Analysatoren sind zu den Hauptwerkzeugen in der Genotypisierung geworden. Diese ermöglichen es, Fragmente, die sich um eine einzelne stickstoffhaltige Base unterscheiden, schnell und kostengünstig zu bestimmen. Wie bei der Agarose-Gelelektrophorese werden DNA-Fragmente zunächst durch PCR vervielfältigt. Allerdings ist ein Primer mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, der dem Fragment Farbe verleiht. Die Proben werden nach Größe getrennt, indem sie durch ein gelartiges Polymer wandern, als Reaktion auf einen elektrischen Strom. Kleinere Fragmente bewegen sich schneller als größere Fragmente. Während die Fragmente zum Ende des Polymers wandern, zeichnet eine digitale Kamera die Farbe auf und sendet die Informationen an einen Computer zur Analyse. Automatisierte Sequenziergeräte werden derzeit in der forensischen Identifikation und Vaterschaftstests verwendet.

Next-Generation-Sequenzer bestimmen ebenfalls Genotypen

Next-Generation-Sequenziergeräte haben sich seit 2006 schnell entwickelt. Diese Technologie kombiniert PCR-Vervielfältigung und Sequenzierung, um Millionen von Basen auf einmal zu bestimmen. Der Prozess beginnt mit PCR; jedoch sind unterschiedliche Primer an Perlen gebunden, die in einer Reaktion gemischt sind, wodurch Tausende von Regionen auf einmal vervielfältigt werden können.

Next-Generation-Sequenzer trennen dann die Fragmente nach Größe und ermöglichen die Analyse einer Vielzahl von DNA-Regionen. Die Methode ist als Genotypisierungswerkzeug nachteilig, wenn Forscher daran interessiert sind, eine einzelne Region des Genoms zu vergleichen. Der Vorteil ist, dass das Genom, das aus einer einzelnen Zelle isoliert wurde, genug Material für die PCR-Vervielfältigung liefert. Der Vergleich der Genotypen normaler und abnormer Zellen, die von einem einzigen Individuum isoliert wurden, kann helfen, Krebszellen und potenzielle Behandlungen zu identifizieren.