NADPH-Oxidase-Assays: Methoden und Anwendungen

Das Enzym NADPH-Oxidase wird als Produzent reaktiver Sauerstoffspezies während Prozessen einschließlich des Wachstums von glatten Gefäßmuskelzellen identifiziert. Diese reaktiven Spezies stehen in Verbindung mit einer Reihe von Krankheiten einschließlich Bluthochdruck, Diabetes, Krebs und Entzündungen; Methoden zur Überwachung der Aktivität dieses Enzyms sind entscheidend für eine mögliche Behandlungsentwicklung.

NADPH-Oxidase

• NADPH-Oxidase gehört zu einer Familie von Enzymen, die den Elektronentransfer zwischen NADPH und Sauerstoff unterstützen. NADPH-Oxidase hat jedoch die einzigartige Fähigkeit, aus dieser Reaktion reaktive Sauerstoffspezies zu produzieren, im Vergleich zu anderen Familienmitgliedern, bei denen reaktive Sauerstoffspezies auf andere Weise erzeugt werden. Ein multimeres Proteinkomplex, NADPH-Oxidase besteht aus dem membrangebundenen Flavocytochrom b558, das als Messmarker verwendet wird.

Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)

• Als Hauptquelle von ROS, insbesondere Wasserstoffperoxid, produziert NADPH-Oxidase kleine, aber konsistente Mengen über sein in Blutgefäßen exprimiertes Isoenzym, das an Signalprozessen beteiligt ist. Diese konsistente Produktion kann schließlich das natürliche Antioxidantensystem überwältigen, was zu einem Verlust schützender Verbindungen wie Stickstoffmonoxid und der Erzeugung noch leistungsstärkerer ROS führt.

Chemiluminescenz-Methode

• Chemiluminescenz ermöglicht eine hochsensible, automatisierte Messung der NADPH-Oxidase-Aktivität über einen Bereich von Konzentrationen. Während dieser Methode wird NADPH-Substrat zu einer Gewebeprobe, die NADPH-Oxidase enthält, hinzugefügt. Bei der Reaktion wird ROS erzeugt und reagiert mit der Verbindung Lucigenin, um einen chemilumineszenten Effekt zu erzeugen, der gemessen wird. Die Lumineszenz ist direkt proportional zur NADPH-Oxidase-Aktivität, da das Enzym die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt.

Kinetischer Assay mittels Durchflusszytometrie

• Bei dieser Methode werden Gewebeproben mittels Durchflusszytometrie analysiert. Knochenmark wird aus der Probe mit Hanks' Balanced Salt Solution getrennt. Spezifische Flecken und nachweisende Antikörper werden der Probe in Polystyrolröhrchen hinzugefügt. Die Probe wird dann inkubiert, mit Hanks' Balanced Salt Solution gewaschen, mit molekularen Sonden markiert und für die Durchflusszytometrie vorbereitet. Kontrollröhrchen werden ebenfalls zum Vergleich und zur Kalibrierung des Durchflusszytometers hergestellt. Die Maschine wird dann gestartet und Messungen aufgezeichnet.