Verfahren zur Messung von NADPH - Oxidase

Die NADPH -Oxidase ist als Produzent von reaktiven Sauerstoffspezies in Prozessen einschließlich dem Wachstum von vaskulären glatten Muskelzellen identifiziert. Diese reaktiven Spezies werden zu einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich Bluthochdruck, Diabetes, Krebs und Entzündung verbunden sind , Verfahren zur Überwachung der Aktivität dieses Enzyms ist für mögliche Behandlungs Entwicklung. NADPH Oxidase

NADPH-Oxidase gehört zu einer Familie von Enzymen, die mit Elektronentransfer zwischen NADPH und Sauerstoff helfen. Jedoch hat NADPH -Oxidase die einzigartige Fähigkeit zur Herstellung von reaktiven Sauerstoff-Spezies aus dieser Reaktion , verglichen mit anderen Familienmitgliedern , wo reaktive Sauerstoffspezies über andere Mittel erzeugt wird. Multimeres Proteinkomplex , NADPH-Oxidase besteht aus dem Membran-gebundenen Flavocytochrom B558 , die als Messmarkierung verwendet wird.
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS ) Erzeugung

die Hauptquelle der ROS , insbesondere Wasserstoffperoxid, NADPH-Oxidase produziert kleine Mengen , aber konsequent über seine Isoform in Blutgefäßen exprimiert , die in Signalprozessen beteiligt sind. Diese konsequente Produktion kann schließlich überwältigen die natürlichen Antioxidationssystem , was zu einem Verlust der Schutz Verbindungen wie Stickstoffmonoxid, und die Erzeugung von ROS noch leistungsfähiger .
Chemilumineszenzverfahren
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Chemiluminescence ermöglicht hochempfindliche , automatisierte Messung der NADPH -Oxidase-Aktivität in einem Bereich von Konzentrationen . Während dieses Verfahrens wird NADPH Substrats auf eine Gewebeprobe enthält, NADPH -Oxidase zugesetzt. Bei der Reaktion , ROS erzeugt und reagiert mit der Verbindung Lucigenin einen chemilluminescent Wirkung , die gemessen wird, zu produzieren. Lumineszenz ist direkt proportional zur NADPH-Oxidase- Aktivität , da das Enzym bestimmt die Geschwindigkeit der Reaktion.
Kinetic Assay über Durchflusszytometrie

In diesem Verfahren , Gewebeproben werden analysiert über Durchflusszytometrie . Knochenmark wird aus der Probe mit Hanks ' Balanced Salt Solution getrennt. Spezifische Flecken und Detektieren von Antikörpern zu der Probe in Polystyrol- Röhrchen gegeben. Die Probe wird dann inkubiert, mit Hanks ' Balanced Salt Solution gewaschen, mit Molekularsonden markiert ist und von Durchflusszytometrie hergestellt. Kontrollröhrchen sind zum Vergleich hergestellt und an das Durchflusszytometer zu kalibrieren. Die Maschine wird dann lief und Messungen aufgezeichnet.