Molekulare Klonungsprotokolle umfassen die Verfahren zum Definieren, Isolieren und Replizieren einer DNA-Sequenz. Traditionelle Restriktions- und Ligation-Klonungsprotokolle initiieren DNA-Fragmentierung mit Restriktionsendonukleasen (Enzymen, die DNA-Stränge an Restriktionsstellen schneiden), DNA-Fragment-Ligation (die Reparatur von Unterbrechungen in DNA-Molekülen), Transfektion (die Einführung von Nukleinsäure in eine Zelle) und Selektion (die Auswahl einzelner Genome für die Replikation).
Isolierung
- Protokolle zur Isolierung eines DNA-Fragments, der erste Schritt in der molekularen Klonung, beinhalten oft eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Zyklen von Erhitzung und Abkühlung verwendet, um DNA-Stücke zu vervielfältigen. Um die Zielsequenzgröße zu erreichen, beinhalten andere Protokolle DNA-Sonikation, Reaktionsenzym-Verdauung und die Verwendung chemisch synthetisierter Oligonukleotide. Diese Protokolle variieren je nach Größe und Menge der benötigten isolierten DNA.
Ligation
- Protokolle für die Ligation beinhalten die Verwendung eines Enzyms, der DNA-Ligase, um DNA-Moleküle mit einer kovalenten Bindung zusammenzufügen. Das Protokoll schreibt vor, DNA-Fragmente, den Klonierungsvektor, einen Ligation-Puffer, die DNA-Ligase und steriles Wasser in einem Mikrozentrifugenröhrchen zu kombinieren und über Nacht bei 4 Grad Celsius zu inkubieren.
Transfektion
- Protokolle für Transfektion, oder das Einbringen von DNA in eine Zelle mittels nicht-viraler Mittel, beinhalten oft das direkte Injizieren von DNA in das Zellplasma. Andere Methoden umfassen die Verwendung von chemischen Reagenzien wie Calciumphosphat und Lipiden, um den Transfektionskomplex durch die Zellmembran zu liefern. Diese Methode testet die Auswirkungen von Genmodifikationen auf die Funktion spezifischer Gene.
Selektion
- Selektion oder Screening-Protokolle bestimmen, welche Zellen die DNA-Einlage erfolgreich gehalten haben, und zeigen an, welche Zellen isoliert werden müssen. Eine Zentrifuge erntet Zellen, die die transfizierte DNA enthalten, die dann in einem Lysozym (ein natürlich vorkommendes Enzym) Puffer inkubiert und mit einem alkalischen Reinigungsmittel behandelt werden, wodurch die Proteine und Membranen löslich werden. Durch die Verwendung von Essigsäure zur Fällung der Proteien filtern eine Zentrifuge und ein Käsetuch den DNA-haltigen Überstand (die lösliche Flüssigkeit, die von einer zentrifugierten Verbindung übrig bleibt). Der Überstand wird mit Polyethylenglykol gefällt, zentrifugiert und in einem Puffer aus Cäsiumchlorid und Ethidiumbromid aufgeschwemmt. Das Ethidiumbromid färbt die DNA nach Dichte, und unter Verwendung von langwelligem UV-Licht wird das untere Band-DNA mit einer Fünf-Kubikzentimeter-Spritze extrahiert. Eine ausgleichende Ionenaustauschsäule trennt die DNA von Ethidiumbromid und Cäsiumchlorid, und das endgültige DNA-Pellet wird in einer Pufferlösung aufgeschwemmt und auf Agarose-Gelelektrophorese nachgewiesen.
