Rekombinante Plasmid-Vermehrung: Ein Leitfaden für die Gentechnik

In einigen Bakterien- und Hefearten vorkommende Plasmiden sind vergleichsweise kleine, selbstreplikierende DNA-Ringe, die sich außerhalb des Hauptchromosoms einer Zelle befinden. Sie sind in der Gentechnik äußerst nützlich, weil es relativ einfach ist, ausgewählte Gene anderer Arten in Plasmiden zu splice, sie zwischen Wirtszellen derselben oder verschiedener Arten zu übertragen und sie zu einer viel höheren als normalen – oder verstärkten – Rate zu replizieren – oder zu vermehren. Rekombinante Plasmiden sind einfach solche, die so konstruiert wurden, dass sie Gene anderer Arten enthalten. Insbesondere bei verstärkter Vermehrung können rekombinante Plasmiden gewünschte Proteine schneller und leichter in großem, industriellem Maßstab exprimieren.

Was Sie benötigen

• Vorhandene Plasmiden- und Genbibliotheken, oder Plasmiden und Gene, die Sie selbst aus ihren Wirtsorganismen isoliert und zusammen gespleist haben
• Zellkulturausrüstung
• Verstärkungsmittel(e) wie Calciumchlorid, elektrischer Schock, Kälte und Hitze, Chloramphenicol, elektrischer Schock und/oder Taq-Polymerase-Enzym

Anleitung

1. Wählen Sie das Verstärkungsverfahren oder die Verfahren, die am besten zu Ihrem spezifischen rekombinanten Plasmid und Wirtsorganismus passen. Einige Verfahren funktionieren besser mit bestimmten Plasmiden und Wirtsorganismen als mit anderen. Wenn Sie mit einem neuartigen, noch experimentellen rekombinanten Plasmid und/oder einer anderen Wirtsart arbeiten, müssen Sie möglicherweise den besten Verstärkungsprozess oder die besten Prozesse durch Ausprobieren bestimmen.

2. Versuchen Sie den sogenannten Transformationsprozess, wenn Ihre spezifische Plasmid- und Wirtszellart darauf reagieren könnte. Kühlen Sie die Zellen und Plasmide auf Null Grad Celsius in einer Calciumchlorid-(CaCl)-Lösung ab. Erhöhen Sie die Temperatur schnell auf 37-43 Grad Celsius. Dieser abrupte Temperaturwechsel führt dazu, dass die Zellmembranen größere Mengen des Plasmids aufnehmen.

3. Senden Sie Hochspannungs-Elektrizitätsimpulse durch die Lösung von Plasmiden und Zellen, wenn Elektroporation die gewünschte Verstärkungsmethode ist. Diese Technik erhöht die Durchlässigkeit der Zellmembranen für die Plasmide.

4. Setzen Sie die Wirtszellkultur niedrigen Konzentrationen des Antibiotikums Chloramphenicol aus, um bis zu einhundert Plasmide pro Zelle zu erzeugen. Diese Methode unterdrückt die Replikation der Hauptchromosomen der Wirtszellen und induziert eine unkontrollierte Replikation des Plasmids, einschließlich des darin eingespleisten Gens.

5. Wenden Sie die Polymerase-Kettenreaktion oder PCR-Methode an, um Plasmidkopien in sehr hoher Größenordnung zu erzeugen. PCR basiert auf der DNA-Polymerisation, der chemischen Reaktion, durch die genetische Sequenzen in der Natur entstehen. PCR wird am häufigsten durch ein hitzestabiles Enzym namens Taq-Polymerase katalysiert, das aus einer Bakterienart gewonnen wird, die in heißen Quellen lebt.