NADH-Nachweis: Methoden und wissenschaftliche Analyse

Nicotinamidadenindinukleotid (NADH), abgekürzt „NAD“, ist ein Coenzym, das in lebenden Zellen vorkommt und chemische Reaktionen in Proteinen hervorruft. Pharmazeutische Unternehmen untersuchen NADH aufgrund seines Stoffwechselprozesses und stellen es synthetisch für verschiedene Zwecke her. Da NADH mikroskopisch klein ist, kann das bloße Auge es nicht erkennen. Sie benötigen wissenschaftliche Tests und ein Assay-Kit, um seine Anwesenheit nachzuweisen.

Benötigte Utensilien

• Trockeneis
• Mikrozentrifuge
• Eppendorf-Röhrchen

Anweisungen

Reagenz-Reconstitution

1. Setzen Sie den Puffermittel auf eine Arbeitsplatte und lassen Sie ihn Raumtemperatur erreichen. Die ideale Temperatur für den Puffer beträgt 22 Grad Celsius.
2. Reconstitutieren Sie die NAD-Zyklus-Enzymmischung mit genau 220 Mikrolitern Puffermittel. Frieren Sie die Lösung bei Temperaturen unter minus 70 Grad Celsius ein.
3. Reconstitutieren Sie den NADH-Entwickler mit 1,2 ml ddH2O. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, bis sie vollständig gelöst ist. Nicht vortexen.
4. Reconstitutieren Sie den NADH-Standard mit 200 Mikrolitern reinem Dimethylsulfoxid.

Probenvorbereitung

1. Waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
2. Zentrifugieren Sie 2x10(5) Zellen für jeden einzelnen Assay in ein Mikrozentrifugenröhrchen und laufen Sie bei 2.000 U/min für 5 Minuten.
3. Extrahieren Sie die Zellen mit 400 Mikrolitern NAD/NADH-Extraktionspuffer durch Gefrieren und Auftauen der Zellen in zwei Zyklen – 20 Minuten auf Trockeneis und 10 Minuten bei Raumtemperatur. Vortexen Sie die extrahierten Zellen für genau 10 Sekunden.
4. Zentrifugieren Sie die Zellproben in einer Mikrozentrifuge bei 14.000 U/min für genau 5 Minuten.
5. Übertragen Sie die NAD/NADH-Zellen in ein sauberes Röhrchen.

Assay-Protokoll

1. Verdünnen Sie 10 Mikroliter des NADH-Standards mit 990 Mikrolitern NAD/NADH-Extraktionspuffer. Geben Sie 0, 2, 4, 6, 8, 10 Mikroliter der verdünnten Lösung in duplikat in ein 96-Well-Platte, um 0, 20, 40, 60, 80, 100-Well-Standard zu erstellen. Füllen Sie das letzte Well mit 50 Mikrolitern des NAD/NADH-Extraktionspuffers.
2. Übertragen Sie 50 Mikroliter der extrahierten Zellproben in duplikat in ein 96-Well-Platte wie zuvor.
3. Bereiten Sie die Zellproben für die NADH-Detektion vor. Zersetzen Sie das NAD aus den Zellproben, indem Sie 200 Mikroliter der extrahierten Zellproben in Eppendorf-Röhrchen geben. Erhitzen Sie die Röhrchen für genau 30 Minuten auf 60 Grad Celsius in einem temperaturgesteuerten Wasserbad. Kühlen Sie die Proben schnell ab, indem Sie die Röhrchen auf Eis legen. Zentrifugieren Sie die Proben in der Mikrozentrifuge, um Niederschläge zu entfernen. Übertragen Sie 50 Mikroliter der zersetzten Proben in duplikat in ein 96-Well-Platte wie zuvor.
4. Mischen Sie den NAD-Zykluspuffer mit 100 Mikrolitern NAD-Zykluspuffer und 2 Mikrolitern NAD-Zyklusenzym. Geben Sie 100 Mikroliter dieser neuen Lösung in jedes Well der NADH-Standards und -Proben.
5. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für genau 5 Minuten. Dieser Prozess wird NAD in NADH umwandeln.
6. Geben Sie 10 Mikroliter NADH-Entwickler in jedes Well. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde und höchstens 4 Stunden stehen.
7. Lesen Sie die Platte und berechnen Sie den NADH.