ELISA-Test: Ein umfassender Leitfaden zu Prinzipien und Verfahren

Ein ELISA, oder enzymgebundener Immunabsorptions-Test, ist eine biochemische Labormethode, die durchgeführt wird, um ein Antigen (wie ein Protein) oder einen Antikörper in einer experimentellen Probe nachzuweisen. Der Test nutzt die Antikörper-Antigen-Bindung und kann auch verwendet werden, um andere zelluläre und molekulare Bindungsmechanismen zu untersuchen.

Benötigte Utensilien

• Testplatte (z. B. 96-Well-Block)
• Fangantikörper (verdünnt auf 5 µg/mL in 50 mM NaHCO2, pH 9,6)
• Sondantikörper/Protein (verdünnt auf verschiedene Konzentrationen)
• Nachweisantikörper (z. B. Peroxidase-gekoppelter Antikörper)
• PT-Puffer (1x PBS, 0,05 Prozent Tween-20)
• Blockierpuffer (1x PBS mit 5 mg/mL BSA oder 5 Prozent Magermilch in 1x PBS)
• Nachweisreagenz (z. B. TMB-Reagenzgemisch)
• Mechanischer Laborschüttler
• Kälterraum oder Kühlschrank
• Pipette und Spitzen

Anleitung

1. Fangantikörper auf 5 µg/mL in 50 mM NaHCO2 (pH 9,6) verdünnen. 50 µL in jeden Well der für die Prüfung verwendeten Probenschale geben. Mit Plastik oder Aluminium abdecken und über Nacht bei 4 Grad C auf einem Schüttler inkubieren.

2. Fangantikörper entfernen und zweimal mit 200 µL PT-Puffer waschen. 200 µL Blockierpuffer pro Well hinzufügen (PBS oder 5 Prozent Magermilch). Zwischen zwei Stunden und über Nacht bei Schütteln bei 4 Grad C inkubieren.

3. Blockierpuffer entfernen und viermal mit 200 µL PT-Puffer waschen. „Sond“-Proteinproben in verschiedenen Konzentrationen in PBS oder 5 Prozent Magermilch hinzufügen, 100 µL pro Well. Eine Stunde lang bei Schütteln bei 4 Grad C inkubieren. Sondlösungen entfernen und sechsmal mit 200 µL PT-Puffer waschen.

4. Nachweisantikörper (HRP-konjugierter Antikörper) verdünnt 1:4000 in PB-Puffer oder 5 Prozent Magermilch (einer davon mit 0,05 Prozent Tween-20) hinzufügen, 50 µL pro Sample-Well. 30 Minuten bis eine Stunde lang bei Schütteln bei 4 Grad C inkubieren.

5. Nachweisantikörperlösung entfernen und 6-mal mit 200 µL PT-Puffer pro Well waschen, gefolgt von zweimaligem Waschen mit 200 µL 1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung). PBS entfernen und 100 µL Nachweisreagenz pro Well hinzufügen (für HRP frisch gemischtes TMB-Reagenz verwenden, indem TMB-Substrat und Peroxid im Verhältnis 1:1 gemischt werden). 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, gelegentlich schütteln. Bei Verwendung von TMB und HRP: Schließlich 100 µL 1M H3PO4 (Phosphorsäure) pro Well hinzufügen, um die TMB-Reaktion zu stoppen. Die Platte mit einem Sample-Analyse-Leser auslesen, wie z. B. einem 96-Well-Plattenleser. (Für HRP und TMB die „ELISA End-Point Assay“-Vorlage verwenden, die auf den meisten Lesern verfügbar ist.)