Gel-Elektrophorese Troubleshooting: Ein umfassender Leitfaden

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ist eine Technik, die häufig zur Trennung organischer Moleküle in einer biologischen Probe verwendet wird. Moleküle mit geringerer Größe und Gewicht wandern schneller auf einem Polyacrylamidgel, wenn ein elektrischer Strom angelegt wird. Klare, deutliche Banden werden im Allgemeinen beobachtet, nachdem das fertige Gel in einem bestimmten Farbstoff inkubiert wurde. Es ist eine relativ einfache Methode. Das Fehlen von Banden oder Banden, die verschmiert oder unsauber sind, könnte auf ein Problem in einem oder mehreren Schritten der Methode hindeuten. Sie sollten grundlegende Richtlinien befolgen, um eine Gel-Elektrophorese-Methode zu troubleshooten, wenn Ihre Ergebnisse nicht den Erwartungen entsprechen.

Dinge, die Sie benötigen

• Bis-Acrylamid in Qualitätsklasse oder vorgefertigte Platten
• Zwei Glasplatten
• Acrylamid: Bis
• TBE-Puffer (TRIS, Borensäure, EDTA)
• Netzteil
• Oberer Puffertank
• Unterer Puffertank
• Protein- oder DNA-Probe
• TEMED
• Ammoniumpersulfat
• Gelfarbstoff

Anleitung

1. Beginnen Sie mit dem letzten Schritt der Gel-Elektrophorese und arbeiten Sie rückwärts. Bei der Gel-Elektrophorese ist der letzte Schritt das Färbeverfahren, das zur Beobachtung von Probenbanden verwendet wird. Während des Färbeverfahrens sollten eigentlich wenige Probleme auftreten. Allerdings sollten pulverisierte Farbstoffe gut in den entsprechenden Puffer aufgelöst werden, bevor sie verwendet werden, um ein Gel zu färben. Vergewissern Sie sich, dass die richtige Konzentration des Farbstoffs verwendet wurde.

2. Überprüfen Sie das Netzteil. Das Fehlen von Banden könnte darauf hindeuten, dass die Strom-oder Spannungseinstellung zu hoch war und die Testproben vom Gel gewandert sind. Hohe Einstellungen können auch dazu führen, dass Probenkomponenten zu schnell durch das Gel wandern, was zu schlechter Auflösung und unsauber aussehenden Banden führt. Proben wandern möglicherweise nicht durch das Gel, wenn die Netzteileinstellung niedrig ist. Proben können auch von der Vertiefung abweichen, in die sie geladen wurden, und nicht durch das Gel wandern.

3. Überprüfen Sie das flüssige Acrylamid, das zum Gießen des Polyacrylamidgels verwendet wird. Typischerweise reicht der Prozentsatz des Acrylamids, das zum Gießen eines Polyacrylamidgels verwendet wird, von 5 bis 15 Prozent. Proben, die aus größeren Molekülen bestehen, werden auf ein 5-Prozent-Gel geladen, da große Fragmente auf Gelen mit einem höheren Acrylamidprozentsatz langsamer wandern. Kleine Moleküle werden auf ein höheres Prozent-Gel geladen, da eine niedrige Gelkonzentration nicht in der Lage wäre, kleinere Proben aufzulösen.

4. Überprüfen Sie die Reagenzien, die zum Polymerisieren des Acrylamids verwendet werden. Ein Polyacrylamidgel entsteht durch die Polymerisierung einer flüssigen Mischung aus Bisacrylamid und Acrylamid. Ammoniumpersulfat und TEMED werden dem Acrylamid zugesetzt, um die Gelbildung zu katalysieren. Typischerweise sollte das Acrylamid 15 Minuten nach Zugabe von Ammoniumpersulfat und TEMED Anzeichen von Polymerisierung (Gelbildung) zeigen. Eine zu schnelle Polymerisierung ist das Ergebnis von hohen Mengen an Ammoniumpersulfat. Zu wenig Ammoniumpersulfat kann zu unvollständiger oder ungleichmäßiger Polymerisierung führen.

5. Bestätigen Sie die Menge der geladenen Proben. Hohe Konzentrationen von Proben können träge durch das Gel wandern und die Bandauflösung verringern. Eine niedrige Probenkonzentration ist möglicherweise nicht mehr zu beobachten, nachdem das Gel gefärbt wurde. Diese Farbstoffe haben Einschränkungen hinsichtlich der minimalen Menge an Probe, die aufgrund der Farbstoffempfindlichkeit abgebildet werden kann.

6. Bestätigen Sie die Qualität der geladenen Proben. Salze und andere Verunreinigungen, die in einer Probe vorhanden sind, können die Bewegung der Probe entlang des Gels beeinflussen. Elektrophorese ist das Ergebnis von elektrischem Strom, der durch ein Gel fließt, das einen stromleitenden Puffer enthält; hohe Salzkonzentrationen in der Probe können die Bewegung dieses Stroms durch das Gel beeinflussen. Ihre Isolierung einer Probe sollte ein Reinigungskit umfassen, das eine relativ reine Probe erzeugt.

7. Überprüfen Sie die Literatur oder das schriftliche Protokoll, um festzustellen, ob die richtige PAGE für das Experiment verwendet wurde. Der Prozentsatz des Acrylamids in PAGE ist spezifisch für die Größe der zu testenden Probe. Die Literatur könnte auch spezifische Informationen bezüglich der Einrichtung des Netzteils und der Geschwindigkeit der Probenmigration liefern.