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Kryokonservierungsverfahren sind solche, die es ermöglichen, Zellen auf unbestimmte Zeit zu lagern, indem extrem niedrige Temperaturen verwendet werden, um die metabolischen Aktivitäten auszusetzen. Es gibt zwei Haupttypen von Kryokonservierungsverfahren: Gleichgewicht (konventionelles langsames Einfrieren) und Nicht-Gleichgewicht oder ultraschnelles Einfrieren (Vitrifikation). Der Begriff Vitrifikation kommt vom Lateinischen „vitreous“ oder glasartig. Beide Verfahren verwenden Kryoprotektantien mit Frostschutz-ähnlichen Eigenschaften, um zelluläre Schäden während des Einfrierens zu verhindern. Sobald Zellen eingefroren oder vitrifiziert sind, können sie auf unbestimmte Zeit gelagert werden, indem sie in flüssigem Stickstoff eingetaucht werden, einem extrem kalten Fluid mit einer Temperatur von -196 °C (-321 °F). Um die metabolische Aktivität in der Zelle beim Auftauen wiederherzustellen, müssen toxische Kryoprotektantien aus der Zelle entfernt und das normale Wasserbilanz allmählich wiederhergestellt werden, während die Zelle auf eine normale Betriebstemperatur zurückgebracht wird.
Kryokonservierungsverfahren sind solche, die es ermöglichen, Zellen auf unbestimmte Zeit zu lagern, indem extrem niedrige Temperaturen verwendet werden, um die metabolischen Aktivitäten auszusetzen. Es gibt zwei Haupttypen von Kryokonservierungsverfahren: Gleichgewicht (konventionelles langsames Einfrieren) und Nicht-Gleichgewicht oder ultraschnelles Einfrieren (Vitrifikation). Der Begriff Vitrifikation kommt vom Lateinischen „vitreous“ oder glasartig. Beide Verfahren verwenden Kryoprotektantien mit Frostschutz-ähnlichen Eigenschaften, um zelluläre Schäden während des Einfrierens zu verhindern. Sobald Zellen eingefroren oder vitrifiziert sind, können sie auf unbestimmte Zeit gelagert werden, indem sie in flüssigem Stickstoff eingetaucht werden, einem extrem kalten Fluid mit einer Temperatur von -196 °C (-321 °F). Um die metabolische Aktivität in der Zelle beim Auftauen wiederherzustellen, müssen toxische Kryoprotektantien aus der Zelle entfernt und das normale Wasserbilanz allmählich wiederhergestellt werden, während die Zelle auf eine normale Betriebstemperatur zurückgebracht wird.
Das Verfahren, das zur Kryokonservierung von Zellen oder Gewebe verwendet wird, hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich der Größe der Zelle, der Menge an zellulärer Flüssigkeit (Zytoplasma) und der Komplexität der Zelle (einzelne Zelle oder Gewebe). Zellen mit einer großen Menge an Zytoplasma wie Eizellen sind schwieriger zu kryokonservieren als Zellen mit nur geringem Zytoplasma, wie Spermienzellen. Die Kryokonservierung von Ovarialgewebe ist anspruchsvoller, da sich in Ovarialgewebe mindestens drei verschiedene Zelltypen unterschiedlicher Größe befinden, jeder mit unterschiedlichen optimalen Einfrierbedürfnissen. Langsam-Einfrieren-Protokolle wurden mit Erfolg bei verschiedenen Zelltypen eingesetzt. Vitrifikation ist derzeit am effektivsten bei der Einfrierung einzelner Zellen und weniger effektiv bei Geweben, aber die Forschung läuft, um die Vitrifikation von Geweben zu optimieren.
Das Zytoplasma einer Zelle enthält Wasser, das bei Gefriertemperatur zu Eiskristallen wird. Wenn Eis sich in einer Zelle bildet, wird die Zelle zerrissen und stirbt. Daher muss die Flüssigkeit in der Zelle entfernt werden, bevor Gefriertemperaturen erreicht werden, um Zellschäden zu vermeiden. Verschiedene Arten von Frostschutzmitteln (Kryoprotektantien) können verwendet werden, um die Zelle vor dem Einfrieren zu dehydrieren, einschließlich Glycerin, Propanediol, Dimethylsulfoxid (DMSO), Ethanol und Zuckern wie Saccharose und Trehalose. Die optimale Abkühlungsrate (und Auftauungsrate) hängt von der Art des verwendeten Kryoprotektantiums und von der Eigenschaft der Zelle oder des Gewebes ab, das (oder das war) eingefroren werden soll. Kryoprotektantien sind toxisch für metabolisierende Zellen, sodass die Exposition von Zellen gegenüber Kryoprotektantien bei wärmeren metabolischen Temperaturen minimiert oder vermieden werden muss. Beim Auftauen oder Erwärmen der Zellen müssen Kryoprotektantien vollständig aus der Zelle entfernt werden, bevor die metabolische Aktivität wiederhergestellt wird.
Die Einfrierrate hängt davon ab, ob das Einfrierenprotokoll auf Gleichgewicht oder Nicht-Gleichgewicht basiert. Bei Gleichgewichtstyp-Verfahren wird die optimale Einfrierrate erreicht, wenn ein Gleichgewicht zwischen der Rate, mit der die Zelle von Wasser dehydriert wird, und der Rate, mit der Wasser außerhalb der Zelle in das Eisstadium umgewandelt wird, besteht. Diese Gleichgewichts- oder langsames Einfrieren-Protokolle dauern in der Regel Stunden, um abgeschlossen zu werden, und ein Computer wird verwendet, um einen programmierbaren Gefrierschrank zu betreiben, um sicherzustellen, dass die Einfrierraten genau wie erforderlich sind. Es gibt typischerweise einen „Halte“-Schritt im Protokoll nahe am Anfang, um die manuelle Erstellung von Starter-Eiskristallen oder „Seeding“ in der Flüssigkeit außerhalb der Zellen zu ermöglichen.
Bei der Vitrifikation wird ein völlig anderer Ansatz zum Einfrieren verwendet, der nicht auf Rampen und dem Erreichen eines Gleichgewichts zwischen Dehydrierung und Eiskristallbildung beruht. Vitrifikation ist so ultraschnell, dass nicht genügend Zeit für die Eisbildung vorhanden ist und die zelluläre Flüssigkeit direkt in eine glasartige oder vitreöse Phase umgewandelt wird, ohne die Zelle zu beschädigen. Programmierbare Gefrierschränke sind nicht erforderlich, da die Zelle direkt in extrem kalten flüssigen Stickstoff getaucht wird und so sofort einen glasartigen Zustand erreicht.
Der erste Schritt des langsam-Einfrieren-Verfahrens besteht darin, die Zelle schrittweise dem Kryoprotektant auszusetzen, um langsam ein Gleichgewicht der Zelle mit dem Kryoprotektant herzustellen, während Wasser freigesetzt wird. Sobald die Zellen von der Mehrheit des zellulären Wassers befreit wurden, werden die Zellen in der Kryoprotektant-Flüssigkeit in einen Behälter irgendwelcher Art platziert, wie z. B. einen Kunststoffstrohhalm, eine Glasampulle oder eine Kunststoffphiole. Das Volumen der Flüssigkeit, die die Zellen für das langsame Einfrieren umgibt, beträgt typischerweise weniger als ein Teelöffel und kann nur ein paar Tropfen betragen. Der vorbeschriftete Behälter wird gefüllt, versiegelt und in einen programmierbaren Gefrierschrank gelegt, der die Temperatur des Behälters über einen Zeitraum von Minuten oder Stunden auf sehr niedrige Temperaturen allmählich senkt. Nach einigen Minuten der Abkühlung müssen Starter-Eiskristalle im Behälter durch „Seeding“ des Behälters gebildet werden. Seeding wird durchgeführt, indem ein Werkzeug (z. B. eine Pinzette), das zuvor in flüssigem Stickstoff vorgekühlt wurde, den Behälter berührt und die Bildung von Eiskristallen verursacht. Dieser Starterkristall wird eine kontrollierte Bildung von Eiskristallen an einer Stelle einleiten, sicher entfernt von den Zellen. Sobald das Seeding abgeschlossen ist, können die restlichen Abkühlungsrampen fortgesetzt werden. Wenn der Behälter Temperaturen zwischen -30 und -85 °C erreicht, kann der Behälter, der die Zellen hält, direkt in flüssigen Stickstoff getaucht werden, um die Abkühlung auf -196 °C abzuschließen.
Ultraschnelle Nicht-Gleichgewichts-Kühlverfahren wie Vitrifikation verwenden höhere Konzentrationen von Kryoprotektantien in Verbindung mit einer fast sofortigen Einfrierrate, die erreicht wird, indem Zellen direkt in flüssigen Stickstoff getaucht werden. Vitrifikation umgeht die Phase der Eiskristallbildung und bewegt das Wasser direkt in eine glasartige Phase. Vitrifikation erreicht denselben Endpunkt wie das langsame Einfrieren, aber bei einer Rate von -3000 °C/min im Vergleich zu 10 °C/min oder mehr. Bei der Vitrifikation werden Zellen normalerweise auf die Spitze eines Strohhalms gelegt und überschüssiger Kryoprotektant wird entfernt, sodass gerade genug übrig bleibt, damit sich die Zelle durch Oberflächenspannung am Behälter festhält, bevor sie in flüssigen Stickstoff getaucht wird. Da das Einfrieren so schnell ist, ist die Expositionsdauer gegenüber Kryoprotektantien viel geringer, und der Zelle können viel höhere Konzentrationen von Kryoprotektantien zugemutet werden. Das Erwärmen der Zelle, um sie wieder zu einer normalen metabolischen Funktion zurückzuführen, muss ebenfalls unglaublich schnell erfolgen. Die Handhabung von vitrifizierten Proben ist viel anspruchsvoller als langsam eingefrorener Proben, da selbst eine kurze Exposition gegenüber einer Temperatur oberhalb der von flüssigem Stickstoff einen ungeplanten Erwärmungsprozess und erneutes Einfrieren auslösen kann, was für die Zelle schädlich ist.
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