Western-Blot-Test: Prinzipien, Verfahren und Anwendungen

Mit dem weltweiten Anstieg der HIV- und AIDS-Fälle wurde eine genaue HIV-Testung unerlässlich. Nach positiven ELISA-HIV-Tests verwenden medizinische Fachkräfte heute einen Western-Blot-Test, um eine positive HIV-Infektion zu bestätigen. Ärzte diagnostizieren die Lyme-Krankheit ebenfalls durch Western-Blot-Tests. Der Test nutzt aufwendige Detektionsmethoden: Medizinisches Personal muss Blutproben von einem Gel auf eine Membran übertragen, um den Detektionsprozess zu erleichtern. Um tatsächlich Antikörper auf der Membran zu identifizieren, verwenden Mitarbeiter spezifische Enzyme, Substrate und/oder Fluorophore.

AP-Enzym

Alkalische Phosphatase (AP) ist eines der primären Enzyme beim Western-Blot-Test. AP hat eine lineare Reaktionszeit, was ihr einen Detektionsvorteil gegenüber anderen Enzymen verschafft. Je mehr Zeit eine AP-Reaktion hat, desto genauer ist der Test. Allerdings kann der längere Zeitraum andere chemische Verbindungen und „Hintergrund“-Geräusche aufnehmen, die die Testergebnisse verfälschen können.

HRP-Enzym

Medizinisches Personal betrachtet Horseradish-Peroxidase (HRP) als überlegen gegenüber AP, aufgrund der kleineren Größe von HRP, der hohen Aktivitätsrate, der Kompatibilität mit der Reaktionsmembran, der Zuverlässigkeit, des niedrigen Preises und der weit verbreiteten Verfügbarkeit.

Chromogene Substrate

Medizinische Fachkräfte betrachten chromogene Substrate als am besten für die Betrachtung der inneren Membranreaktion von Blut und Enzym. Chromogene Substrate sind nicht so empfindlich wie andere Substrate und neigen dazu, zu verschwinden, sobald der Blot trocknet. Für eine schnelle visuelle Testbestätigung sind chromogene Substrate jedoch eine effektive Wahl.

Chemilumineszente Blotting-Substrate

Chemilumineszente Blotting-Substrate erfordern eine konstante Reaktion für einen erfolgreichen Test. Wenn das Enzym die Aktivität einstellt oder das Substrat aufgebraucht ist, geht das Testergebnis verloren. Bei einem optimalen Test ist das Testergebnis jedoch innerhalb von einem bis 24 Stunden verfügbar. Medizinisches Personal verwendet digitale Bildgebungsgeräte oder Röntgenstrahlen, um das Testergebnis tatsächlich zu sehen, da das bloße Auge es nicht erkennen kann.

Fluorophore

Wenn medizinisches Personal nicht mit Enzymen und ihren jeweiligen Substraten testet, verwendet es fluorophore-konjugierte Antikörper. Der Fluorophore-Test erfordert weniger Schritte, benötigt jedoch spezielle Ausrüstung. Der Test erfordert eine Anregungslichtquelle, die die richtige Reaktion auf der Membran auslöst. Fluorophore und die Beleuchtungsausrüstung sind teuer, aber medizinisches Personal hat den Vorteil, mehrere Fluorophore im selben Experiment verwenden zu können.