HPLC steht für Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, ein standardmäßiges qualitatives und quantitatives Analyseverfahren, das in analytischen Laboren verwendet wird. HPLC ist zuverlässig und wiederholbar, was es zur bevorzugten Technik für das Trennen, Identifizieren und Quantifizieren von Molekülen aus komplexen Mischungen aus chemischen und biologischen Komponenten macht.
Vier Komponenten
- Die HPLC-Technik enthält vier Hauptkomponenten. Erstens ist das Liefersystem für das Lösungsmittel (die mobile Phase), das die Proben durch die Säule transportiert, wichtig, da die Polarität die Fähigkeit des Systems beeinflusst, die Moleküle zu trennen. Die Chromatographiesäule ist normalerweise eine vertikale Glassäule, die mit einem Adsorbans gefüllt ist. Zweitens ist das Adsorbans (auch stationäre Phase genannt, da es sich nicht bewegt) üblicherweise Kieselgel oder Aluminiumoxid. Drittens besteht das Probeninführungssystem aus einer Art Injektionsport, um die zu analysierende Probe in das Liefersystem für das Lösungsmittel einzuführen. Die vierte Komponente ist der Detektor.
Detektoren
- Die Art des verwendeten Detektors hängt von der Art der Probe ab, die die Techniker ausführen, und davon, welche Moleküle sie isolieren möchten. Die Kriterien, die der Techniker bei der Auswahl eines Detektors verwendet, umfassen Selektivität, Signal-Schum-Verhältnis, Nachweisgrenze, linearen Bereich, Zeitkonstante, Drift und Zellvolumen. Häufig verwendete Detektoren umfassen Ultraviolett-Sicht-Detektoren, Massenspektrometer, Brechungsindexe, Fluoreszenzdetektoren oder Verdunstungslichtstreuungsgeräte.
Verfahren
- Schalten Sie den Detektor, die Pumpen (die verwendet werden, um Druck hinzuzufügen, um die mobile Phase durch die stationäre Phase zu bewegen) und den Computer ein, der das Chromatogramm aufzeichnen und ausdrucken wird. Wählen Sie die entsprechenden Programme, um die gewünschten Daten zu sammeln. Injizieren Sie die Probe in den Injektionsport. Behalten Sie den Druck im Auge. Jeder Säulentyp hat einen maximalen Druck; überschreiten Sie diesen nicht, sonst erfolgt keine Trennung. Drucken Sie das Chromatogramm aus und analysieren Sie die Ergebnisse. Am Ende jedes Laufs ist es wichtig, den Injektionsport zu spülen, um Ablagerungen zu vermeiden, die Verstopfungen verursachen können.
Typen
- Die hydrophile Interaktionschromatographie verwendet eine gebundene polare stationäre Phase und eine unpolare, wasserlösliche mobile Phase, um Moleküle basierend auf Polarität zu trennen. Diese Technik hat die Fähigkeit, saure, basische und neutrale Proben in einem einzigen Chromatogramm zu trennen.
Die Normalphasenchromatographie verwendet eine polare stationäre Phase und eine unpolare, wasserfreie mobile Phase, um Strukturisomere (Moleküle mit derselben Molekülformel, bei denen Atome auf unterschiedliche Weise miteinander verbunden sind) zu trennen.
Die Umkehrphasenchromatographie ist der am weitesten verbreitete Typ von HPLC. Sie verwendet eine unpolare stationäre Phase und eine wässrig etwas polare mobile Phase. Diese Methode wird häufig von Pharmaunternehmen verwendet, um Medikamente vor der Markteinführung zu qualifizieren.
Die Größenausschlusschromatographie trennt Moleküle basierend auf ihrer Größe und kann auch die Struktur von Proteinen bestimmen.
Die Ionenaustauschchromatographie basiert auf der Anziehung zwischen den Ionen im Gelöststoff und den geladen gebundenen Stellen auf der stationären Phase.
Verwendungen
- HPLC ist nützlich in einer Vielzahl von Anwendungen. Es kann verwendet werden, um pharmazeutische Materialien zu analysieren, was bei der Erforschung neuer Arzneimittel sowie bei der Reinigung bestehender hilfreich ist. Es wird auch verwendet, um biologische Flüssigkeiten, Pestizide, Sprengstoffe und andere Materialien zu analysieren. Obwohl es eine beliebte Technik für biomedizinische, biochemische und pharmazeutische Forschung ist, wird es auch in der Kosmetik-, Lebensmittel-, Umwelt- und Energieindustrie verwendet.
