Plaque-Test: Prinzipien, Anwendungen & Virus-Titration

Was ist ein Plaque-Test?

Ein Test ist eine Technik, die verwendet wird, um Viren zu isolieren und zu reinigen und um Virus-Titer zu bestimmen (die niedrigste Konzentration von Virus, die zu einer Infektion führt). Ein Plaque-Test, ursprünglich ein virologischer Test genannt, wurde entwickelt, um die Infektiosität von Bakteriophagen zu messen und zu zählen. Laut Biology-Online.org wurde er später auch auf Säugetierviren angewendet.

Die Fakten

Eine Plaque ist eine konfluente, monolayerige Zellkultur. Sie entsteht als Ergebnis der Infektion einer der Zellen durch ein einzelnes Viruspartikel, laut Biology-Online.org. Sobald die Zelle infiziert ist, repliziert sich das Virus und tötet die Zelle schließlich. Darüber hinaus verbreiten sich die neu replizierten Viruspartikel, infizieren und töten die benachbarten Zellen.

Funktion

Bei einem Plaque-Test wird die Kultur zunächst mit einem bestimmten Farbstoff gefärbt. Dieser Farbstoff färbt nur lebensfähige (lebende) Zellen, laut Biology-Online.org. Infolgedessen erscheinen die toten Zellen in der Kultur unfärbt, vor dem gefärbten Hintergrund. Derzeit wird der Plaque-Test angewendet, um Zellen zu erkennen, die Antikörper produzieren, die Erythrozyten durch Hämolyse zerstören.

Merkmale

Erythrozyten sind Zellen (auch rote Blutkörperchen genannt), die Hämoglobin enthalten und Sauerstoff und Kohlendioxid im Blut von Lunge und Geweben transportieren. Hämolyse tritt auf, wenn Erythrozyten aufbrechen und Hämoglobin freisetzen, laut Biology-Online.org. Infolgedessen ist die Grundlage im Plaque-Test eine klare Plaque und zeigt an, dass die roten Blutkörperchen durch die Antikörper hämolysiert wurden.

Methode Teil I

Zehnfache Verdünnungen eines Virusbestands werden vor der Durchführung eines Plaque-Tests vorbereitet, und 0,1 mL Aliquot werden auf die Zellmonolayer gebracht. Diese Mischung wird für einen Zeitraum inkubiert, damit das Virus Zeit hat, die Zellen anzugreifen. Darüber hinaus werden die Monolayer von einem Nährmedium bedeckt, das eine Substanz (normalerweise Agar) enthält, laut „Detecting Viruses: A Plaque Assay“ von Vincent Racaniello. Das Nährmedium bildet ein Gel, und nachdem die Kultur inkubiert wurde, geben die ursprünglich infizierten Zellen virale Nachkommen ab. Das Gel begrenzt die Ausbreitung des Virus auf umliegende Zellen, und als Ergebnis produziert das infektiöse Partikel eine kreisförmige Zone namens Plaque. Mit der Zeit wächst die Plaque auf eine mit bloßem Auge sichtbare Größe heran, und Farbstoffe werden verwendet, um die Sichtbarkeit zu verbessern.

Methode Teil II

Der Virus-Titer wird in plaque forming units, PFU pro Milliliter, berechnet. Sie werden gezählt, und um Fehler zu minimieren, werden nur Platten gezählt, die zwischen 10 und 100 Plaques enthalten. Darüber hinaus variiert laut „Detecting Viruses: A Plaque Assay“ bei jeder 100 gezählten Plaques der gleiche Titer um plus oder minus 10 Prozent. Daher beträgt der geschätzte Fehler eines Plaque-Tests etwa 10 Prozent, wenn er korrekt durchgeführt wird.