Agarosegel-Färbung
Die Visualisierung von Nukleinsäure oder Protein ist bei der Agarosegelelektrophorese unerlässlich. Wenn Sie ohne Färbung des Gels arbeiten, können Sie nicht sehen, wo die Probe, die Sie testen, hingelangt ist, und daher sind Messungen der Molekülgröße, zum Beispiel, stark eingeschränkt. Färben Sie Ihr Gel mit einem üblichen, bewährten Farbstoff wie Ethidiumbromid (EtBr), das unter ultraviolettem (UV) Licht fluoresziert, wenn es in DNA- oder RNA-Moleküle intercaliert ist. Der Farbstoff wird Ihnen bei Ihrem Experiment helfen, indem er die Moleküle in Ihrer Probe als dunkelblaue Markierungen anzeigt.
Benötigte Dinge
- Schutzhandschuhe und Schutzbrille
- Agarosegel
- Ethidiumbromid
- Pipette (Gilson für kleine Mengen)
- Puffer zum Laden
Anweisungen
- Tragen Sie Schutzhandschuhe, die dünn, aber schützend sind und Ihren Fingern und Händen uneingeschränkte Bewegung ermöglichen. Verwenden Sie eine kleine Pipette, um etwas EtBr (oder gleichwertigen Fleck) aus seinem Behälter zu ziehen.
- Fügen Sie 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Ihres gewählten Flecks zu Ihrer Probe hinzu. Decken Sie die Probe ab und mischen Sie sie manuell. Mehreres Schütteln sollte ausreichen.
- Fügen Sie mit einer Pipette einen negativ geladenen Ladepuffer zur Mischung hinzu. Dies ermöglicht es, die gefärbte Probe mit bloßem Auge bei Tageslicht zu sehen und macht den Bedarf an teurem, schädlichem UV-Licht überflüssig, das sonst die Moleküle, an denen Sie interessiert sind, abbauen würde. Xylencyanol ist ein häufig verwendeter Ladepuffer, aber andere sind verfügbar. Stellen Sie sicher, dass Sie einen Ladepuffer auswählen, der mit derselben Geschwindigkeit läuft wie das Molekül, das Sie messen. Xylencyanol läuft mit derselben Geschwindigkeit wie DNA-Fragmente von 5000 Basenpaaren (bp) Länge.
- Verwenden Sie eine saubere Pipette, um Ihre verbesserte Probe auf die Mulden am Anfang Ihres Agarosegels aufzutragen. Das Volumen, das Sie auftragen, hängt von der Größe der Gelkämme ab (Muldendicke und -länge sowie Geltiefe). Färben Sie Ihre Probe und nicht die Kontrolle, damit Sie die Parameter, die Sie interessieren (wie Molekulargewicht), korrekt und effektiv bestimmen können.
- Alternativ führen Sie einen Southern Blot durch, um Ihre Probe zu visualisieren. Übertragen Sie die DNA auf eine Nitrozellulose-Membran. Setzen Sie sie einem Hybridisierungssond aus. Dies ist keine Färbung im engeren Sinne, bietet aber eine geeignete Alternative, wie von Access Excellence beschrieben.
