Einleitung
Genomische DNA liefert den Bauplan für Zellen, um sich zu lebenden Organismen zu organisieren. DNA enthält vier sich wiederholende stickstoffhaltige Basen namens Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin. Forschern ist es gelungen, die gesamte Basensequenz, das Genom, für viele komplexe Organismen einschließlich des Menschen zu bestimmen. Es gibt viele wichtige Gründe, ein Genom zu sequenzieren. Die medizinische Genetik befasst sich mit der Entdeckung genetischer Abnormalitäten, die Krankheiten wie Diabetes, Alzheimer und Krebs verursachen. Evolutionsgenetiker vergleichen Genome verwandter Arten, um eine akkurate Taxonomie zu entwickeln. Grundlegende genetische Protokolle in der Forschung sind gleich, unabhängig vom Zweck der Forschung.
DNA aus Zellen isolieren
- Genetische Forschung erfordert die Extraktion einer reinen DNA-Probe aus Zellen. Ein grundlegendes Protokoll beginnt mit der Störung und Entfernung schützender Pflanzenzellwände oder tierischer Zellmembranen mit einem Enzym namens Lysozym. Nicht-genetische Zellbestandteile in Form von Fällungen werden durch schnelles Drehen mit einer Zentrifuge entfernt, während die DNA in Lösung verbleibt. Die DNA wird dann in Gegenwart von Natriumacetatsalz mit Ethanol ausgefällt. Die endgültige Zentrifugation fällte und pelletiert reines genetisches Material für Forschungszwecke.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
- Genetische Forschung erfordert ausreichend Kopien bestimmter DNA-Bereiche. Die Polymerase-Kettenreaktion oder PCR ist eine Methode zur exponentiellen Herstellung von DNA-Kopien. Das Protokoll erfordert gereinigte DNA, Taq-Polymerase, Basen namens Desoxynukleotide und kleine DNA-Stränge, um den bezeichneten Bereich zu präparieren. Die Reaktionsmischung wird in einen Thermocycler gelegt, ein Instrument, das schnelle Temperaturänderungen ermöglicht. Das Erhitzen der Mischung auf 95 Grad Celsius trennt doppelsträngige DNA, dann wird sie auf 48 Grad abgekühlt, damit Primer sitzen oder an passenden Basen anlagern können. Die Temperatur wird auf 72 Grad erhöht, wenn die Taq-Polymerase Desoxynukleotide zusammenfügt, genannt Extension, zu einer neuen Kopie der DNA.
Genetische DNA-Sequenzierung
- Automatisierte Sequenzierung wird verwendet, um die genaue Basensequenz zu bestimmen und normale mit abnormer DNA zu vergleichen. Das Protokoll fügt normalen PCR-Reaktionen fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotide oder ddNTPs hinzu, die zufällig die Verlängerung von DNA-Fragmenten stoppen. Die Produkte sind DNA-Fragmente, die sich durch eine einzelne Base unterscheiden. Jeder Basentyp hat eine andere Farbe. Die Endprodukte werden auf einem automatischen Sequenzer geladen, einem Instrument, das darauf ausgelegt ist, Fragmente nach Größe auf einem Polymer mithilfe von elektrischem Strom zu trennen. Wenn die Fragmente das Polymerende erreichen, zeichnet eine digitale Kamera die Basenfarbe auf und sendet die Daten an einen Computer zur Analyse.
Genotypisierung und DNA-Fingerabdruck
- Genotypisierung ist eine Methode, die kleine Segmente eines Genoms von einem Organismus mit einem anderen vergleicht. Das Ziel ist es, kleine Unterschiede in der PCR-Fragmentgröße zu erkennen, die durch normale oder zufällige Basisänderungen in der DNA entstehen. Das Protokoll-Design beginnt mit einer grundlegenden PCR unter Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Primers zur Detektion auf automatischen Sequenzern. Markierte Produkte werden nach Größe getrennt und von einer digitalen Kamera an einen Computer zur Analyse aufgezeichnet. Genotypisierungsprotokolle sind für die forensische Identifizierung, DNA-Fingerabdruck und Vaterschaft oder die Identifizierung genetischer Abnormalitäten, die zu Krankheiten führen, konzipiert.
