Protease-Substrat-Markierung: Best Practices für die Produktidentifizierung

Proteine sind eine Komponente jeder Zelle im Körper. Proteasen (auch als proteolytische Enzyme oder Proteinase bezeichnet) sind Verdauungsenzyme, deren Funktion es ist, Proteine abzubauen. Neben der Verdauung sind Proteasen auch wesentlich für Blutgerinnung, Stoffwechselkontrolle und Immunregulation. Während des biochemischen Prozesses (Katalyse) binden Substrate an die aktive Stelle des Enzyms und werden in ein oder mehrere Produkte umgewandelt, die dann von der Stelle freigesetzt werden. Dieser Prozess kann erweitert oder gehemmt werden, um Reaktionen im Körper zu erhöhen oder zu reduzieren, je nach gewünschtem Ergebnis. Die Kennzeichnung von Substratprodukten ermöglicht es Wissenschaftlern, diese enzymatische Aktivität zu messen. Fluoreszenzmarkierung ist eine Technik, um bestimmte Moleküle zu färben, wodurch sie leichter zu verfolgen sind.

Was Sie benötigen

• Zielmolekül-Cocktail
• Fluoreszenzfarb-Markierungsset
• Fluoreszenzmessgerät

Anleitung

Wie man Protease-Substratprodukte markiert

1. Wählen Sie Ihren Fluoreszenzfarbstoff. Gängige Farbstoffe umfassen Rhodamin und Fluorescein. Diese können in der Regel von Herstellern gekauft werden.

2. Führen Sie die Reaktion durch und entfernen Sie nicht verwendetes Fluorophor von den Zielmolekülen mittels Größenausschlusschromatographie (ein Prozess, der Moleküle basierend auf ihrer Größe trennt). Farbstoffentfernungssäulen werden ebenfalls häufig verwendet. Diese werden oft mit Markierungssets beworben.

3. Erkennen Sie die Moleküle. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmessgerät, wie ein Fluoreszenzmikroskop. Licht einer bestimmten Wellenlänge wird durch das Molekül (indirekt bei einigen Techniken) geleitet und beleuchtet das Fluorophor.

4. Nehmen Sie Ihre Messungen vor. Da Assays messen, wie viel Substrat verbraucht wurde oder die Menge des freigesetzten Produkts über einen Zeitraum, können Enzymmengen in Mol (physische Menge) oder in Einheiten (Aktivität) gemessen werden.