Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC): Isolations- & Kryokonservierungsprotokoll

Kryokonservierte periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) sind eine häufige Quelle von Proben für Forschung, die Immuntherapien und Reaktionen auf Impfstoffe umfasst. Während einige Protokolle auf die Isolations- und Einfrierphasen des Prozesses beschränkt sind, umfassen andere Auftauverfahren.

Isolationsverfahren und Einfrierverfahren

• Eine kommerzielle Verbindung zur Förderung der Trennung wird in jede 50-mL-Zentrifugenröhre gegeben und die Röhren werden dreißig Sekunden lang zentrifugiert. Die Kappen von Blutröhren werden vor dem Öffnen mit Alkohol besprüht, dann wird anticoagulativ behandeltes Vollblut per Pipette in die Zentrifugenröhren übertragen. Die Plasmaschicht des Blutes wird mit einer Pipette abgesaugt.

Einfrieren

• Die Zellen aus dem vorherigen Schritt werden dann dreimal mit gepufferter Kochsalzlösung zentrifugiert. Nach einer Zellzählung werden die Proben zentrifugiert und dann in Einfriermedium suspendiert. Proben im Einfriermedium werden anschließend in einer Menge von 1 mL auf Kryovials aufgeteilt. Die Vials werden über Nacht in einem Gefrierschrank bei -70 °C gelagert und am nächsten Tag zur Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff überführt.

Sicheres Auftauen

• Kryovials werden aus flüssigem Stickstoff in ein 37 °C-Wasserbad übertragen und die Probe wird ein bis zwei Minuten lang aufgetaut. Ein warmes Transportmedium wird jedem Vial hinzugefügt. Die verdünnte Zellsuspension wird sieben Minuten lang zentrifugiert. Die Anzahl und die Zellvitalität werden überprüft. Wenn die Zellen konzentriert werden müssen, werden die Proben weitere sieben Minuten lang zentrifugiert. Die Probe wird auf Arbeitslösung verdünnt und zwölf bis achtzehn Stunden ruhen gelassen, bevor mit der Untersuchung gemäß dem angegebenen Protokoll begonnen wird.