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Gelelektrophorese ist eine Methode zur Trennung, Identifizierung und Charakterisierung von Mischungen aus Proteinen oder Nukleinsäuren. Denaturierte Proben migrieren nach Anwendung von Elektrizität in einem dünnen, nassen Gel, das typischerweise aus Polyacrylamid oder Agarose besteht. Die getrennten Proben werden gefärbt, damit sie sichtbar werden können. Gelelektrophorese wird in der Protein- und Nukleinsäureforschung sowie in Krankenhäusern eingesetzt, um ungewöhnliche Proteine oder DNA-Muster zu identifizieren, um Krankheiten, genetische Defekte und genetische Beziehungen zu diagnostizieren.
Wenn ein Detergent wie Natriumdodecylsulfonat (SDS) zu einem Protein oder einer Nukleinsäure hinzugefügt wird, wird das Detergent mit den Proteinen und Nukleinsäuren assoziieren und sie entfalten (denaturieren). Die Denaturierung von Proteinen erleichtert die Bestimmung ihres Molekulargewichts bei der Elektrophorese. Die benötigte Probenmenge beträgt typischerweise 100 bis 500 Nanogramm pro Probenband für Proteine und 5 bis 100 ng pro Band für Nukleinsäuren in einem Gesamtvolumen von etwa 25 bis 40 Mikrolitern.
Ein Gel, typischerweise aus Polyacrylamid oder Agarose, kann hergestellt oder gekauft werden, um diese Proteine zu trennen. Das Gel ist sehr ähnlich wie Gelatine. Es besteht hauptsächlich aus Wasser, ist aber fest genug für die Handhabung. Die Gele enthalten Puffer, um den pH-Wert zu kontrollieren. Das Gel ist sehr dünn (1 bis 2 mm) und rechteckig. Eine Seite sieht aus wie ein Kamm mit vielen fehlenden Zähnen. Die Lücken werden Mulden genannt.
Man legt das Gel in eine Kammer mit Puffer und fügt denaturierte Proteine in die Mulden hinzu. Proben mit bekannten Molekulargewichten werden in die äußeren Mulden gegeben. Gele werden mit unterschiedlichen Mengen an Polyacrylamid hergestellt. Eine niedrige Gelstärke (4 Prozent) eignet sich besser zur Trennung von Molekülen mit hohem Molekulargewicht, während eine höhere Gelstärke (12 Prozent) für Moleküle mit höherem Molekulargewicht verwendet wird. Ein Gradientgel variiert in der Gelstärke und kann eine breite Palette von Proteinen mit Verlust einiger Auflösung trennen.
Bei Anwendung einer hohen elektrischen Spannung bewegen sich die denaturierten Proteine zum Boden der Mulde. Je höher das Gewicht des Proteins, desto langsamer bewegt es sich. Wenn der Strom ausgeschaltet wird, hören die Proteine auf, sich zu bewegen. Man entfernt das Gel aus der Kammer und schaukelt es in einer Schale mit Farbstoff. Organische Farbstoffe wie Coomassie Blau oder Metallfarbstoffe werden verwendet, um Proteine zu färben, während fluoreszierende Farbstoffe wie Ethidiumbromid für Nukleinsäuren verwendet werden.
Nach Entfernung von überschüssigem Farbstoff kann man sehen, dass sich Mischungen in Bändern trennen, die wie Leitern aussehen. Die Position der Bänder wird mit der Entfernung verglichen, die von den Standards zurückgelegt wurde, um das Molekulargewicht der Probe in jedem Band zu bestimmen. Das Gel kann mit Alkohol dehydriert und getrocknet werden, damit es aufbewahrt werden kann. Die Farbintensität des Bands kann dann gemessen werden, um die Konzentration des Proteins in jedem Band zu bestimmen.
Standardprotokolle sind für die Arbeit mit bekannten Proteinen verfügbar. Wenn ein Forscher mit einer unbekannten Probe arbeitet, müssen möglicherweise die Gelstärke, der Puffertyp, der pH-Wert des Puffers, die Spannung, die Laufzeit und der Farbstoff optimiert werden, um die beste Trennung und das beste Signal zu erzielen.
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