Die Immunfluoreszenz (IF) nutzt fluoreszenzmarkierte Antikörper, um Antigene sichtbar zu machen. Die Markierungsstrategie definiert Sensitivität, Flexibilität und Kosten.
Direkte IF (DIF)
- Primärantikörper direkt an Fluorochrom gekoppelt.
- Einstufiges Protokoll; schneller.
- Niedriges Signal (1 Fluor/Antikörper).
- Höherer Hintergrund, falls der Primärantikörper unspezifisch bindet.
- Eingeschränktes Multiplexing (jeder Primärantikörper benötigt einzigartigen Fluor).
Indirekte IF (IIF)
- Unmarkierter Primärantikörper + fluorochromgekoppelter Sekundärantikörper (anti-Spezies-IgG).
- Zweistufiges Protokoll.
- Signalverstärkung: Mehrere Sekundärantikörper binden an einen Primärantikörper → 5–10× helleres Signal.
- Höhere Sensitivität: Erkennt Antigene mit geringer Häufigkeit.
- Flexibilität: Ein Sekundärantikörper funktioniert für alle Primärantikörper derselben Wirtsart. Fluorophore zum Multiplexing austauschbar.
- Niedrigerer Hintergrund: Sekundärantikörper bindet nicht direkt an Probeantigene.
- Kosteneffizient: Sekundärantikörper günstig/wiederverwendbar; Primärkoppelung teuer.
Vergleichstabelle
| Merkmal | Direkt | Indirekt |
|---|
| Schritte | 1 | 2 |
| Sensitivität | Niedriger | Höher (verstärkt) |
| Multiplexing | Eingeschränkt | Einfach (spezies-spezifische Sekundärantikörper) |
| Hintergrund | Höheres Risiko | Niedriger |
| Kosten pro Assay | Höher (gekoppelte Primärantikörper) | Niedriger (gemeinsame Sekundärantikörper) |
| Zeit | Kürzer | Länger (Inkubation + Waschen) |
Wann welches Verfahren?
- DIF: Antigene mit hoher Häufigkeit, schnelles Screening, Durchflusszytometrie (wo Verstärkung nicht nötig), validierte klinische Assays.
- IIF: Forschung, Ziele mit geringer Expression, Multiplex-Panel, ANA/ANCA-Diagnostik, Gewebefärbung.
