Agarose-Gelelektrophorese: Ein Leitfaden zur DNA-Fragmentanalyse

Agarose-Gelelektrophorese ist die häufigste Methode der visuellen DNA-Fragmentanalyse, die es Technikern ermöglicht, DNA-Fragmente anhand der Größe visuell zu unterscheiden. Das Agarosegel hält ein Magnetfeld aufrecht, und da DNA eine negative Ladung hat, bewegt es sich zum positiven Ende des Magnetfeldes. Kleinere DNA-Fragmente bewegen sich schneller durch das Gel, größere Fragmente bewegen sich langsamer. DNA-Fragmente werden mit einem Interkalationsmittel namens Ethidiumbromid fluoreszierend gefärbt. Dies ermöglicht den Vergleich mehrerer elektrophoreterter DNA-Proben auf einem Gel.

Dinge, die Sie benötigen

• Agarosegel, 0,7 bis 2 Prozent
• Tris-Borat-EDTA (TBE), Tris-Acetat-EDTA (TAE), Natrium-Lithium-Acetat (LA), Borsäure (SB) Puffer
• Ethidiumbromid
• Gel-Ladefarbe
• Gel-Fach
• Elektrophoresekammer
• Handschuhe
• Schutzbrille
• Pipette
• Elektrophorese-Kamm

Anleitung

Vorbereitung eines 0,7-prozentigen Agarosegels

Schritt 1: Wiegen Sie 0,7 Gramm Agarosepulver ab und geben Sie es in einen großen (250 ml) Konischenkolben.

Schritt 2: Geben Sie 100 ml eines 1X (normaler Stärke) Puffers (TAE, TBE, SB oder LB Puffer) in den Konischenkolben mit dem Agarosepulver.

Schritt 3: Erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle oder mit einem Bunsenbrenner etwa eine Minute lang, bis die Lösung klar ist und das Agarose aufgelöst ist.

Schritt 4: Nehmen Sie den Kolben von der Wärmequelle und lassen Sie ihn auf 55 bis 60 Grad Celsius abkühlen.

Schritt 5: Geben Sie 1 Mikroliter (µL) Ethidiumbromid mit einer entsprechend dimensionierten Pipette, normalerweise 1 ml, zur abgekühlten Agarose-Lösung. Schwenken Sie die Lösung, um sie zu mischen.

Schritt 6: Gießen Sie das Gel langsam in das Gel-Fach, und stellen Sie sicher, dass während dieses Prozesses keine Blasen entstehen. Wenn dem Gel-Fach keine Brunnenwände beiliegen, verwenden Sie Klebeband, um sie zu formen.

Schritt 7: Setzen Sie einen Elektrophorese-Kamm vorsichtig in das Gel, stellen Sie einen festen Sitz und die richtige Ausrichtung sicher. Elektrophorese-Kämme können stark variieren in der Anzahl der Zähne, die sie haben. Lassen Sie das Gel etwa 25 Minuten lang fest werden.

Schritt 8: Tauchen Sie das Gel in denselben Puffer, der zur Vorbereitung der Agarose-Lösung verwendet wurde – in diesem Fall ein 1X-Puffer. Tauchen Sie das Gel in bis zu 5 ml Laufpuffer ein.

Vorbereitung und Beladen von DNA in das Agarosegel zur Analyse

Schritt 9: Übertragen Sie 5 bis 10 µL Ihrer Probe(n) aus ihren Reaktionsgefäßen in frische Gefäße. Wenn Sie die gesamte Reaktionsmischung verwenden möchten, ist ein frisches Gefäß nicht erforderlich.

Schritt 10: Geben Sie 0,2X Ladepuffer zu jedem Ihrer frischen Probengefäße mit Ihrer DNA-Probe zum Laden hinzu.

Schritt 11: Entfernen Sie den Elektrophorese-Kamm langsam, und stellen Sie sicher, dass Sie das Gel nicht brechen oder einen Spalt zwischen dem Boden des Gels und dem Gel-Fach erzeugen.

Schritt 12: Geben Sie fünf bis 12 µL eines geeigneten DNA-Markers in den ersten Brunnen, der vom Elektrophorese-Kamm erstellt wurde. Ob ein DNA-Marker geeignet ist, hängt von der Größe der Fragmente ab, die Sie von Ihrer Probe erwarten.

Schritt 13: Laden Sie fünf bis 10 µL Ihrer Proben in die verbleibenden Brunnen und geben Sie eine gleiche Menge desselben DNA-Markers in den letzten Brunnen.

Schritt 14: Setzen Sie die Elektroden in die Elektrophoresekammer, indem Sie die Drähte in die richtigen Buchsen der Kammer einstecken, und stellen Sie die Elektrode auf 50 bis 150 V ein.

Schritt 15: Lassen Sie das Gel ein bis vier Stunden lang laufen.

Analyse der Ergebnisse

Schritt 16: Nehmen Sie das Gel aus der Gel-Kammer und legen Sie es entweder in einen UV-Raum zur visuellen Identifizierung oder legen Sie es in eine Maschine, die ein Foto des Gels aufnehmen kann.

Schritt 17: Messen Sie die Wanderstrecke der Marker in ihren Brunnen.

Schritt 18: Tragen Sie die Strecken gegenüber der Größe der Banden auf halblogarithmischem Millimeterpapier auf und zeichnen Sie eine Bestehungslinie.

Schritt 19: Berechnen Sie die Strecken Ihrer unbekannten Banden.

Schritt 20: Schätzen Sie die Größen Ihrer unbekannten Banden, indem Sie eine Linie von der von Ihren unbekannten Banden zurück gelegten Strecke nach oben ziehen, die die Bestehungslinie trifft.

Schritt 21: Zeichnen Sie eine weitere Linie von diesem Treffpunkt über zur Größenachse.