Gewebe-Plasminogen-Aktivator oder TPA ist eine Art Serinprotease, ein Protein, das in der Lage ist, Blutgerinnsel zu zerstören. TPA kommt in den Zellen vor, die die Blutgefäße innen auskleiden. TPA-Protokolle sind Teil der pharmazeutischen und medizinischen Forschung zu Schlaganfällen sowie zu Herzerkrankungen und Lungenerkrankungen wie Lungenembolie und Herzinfarkt. Die Reinigung von TPA bezieht sich auf die Isolierung dieses Proteins von anderen Molekülen durch eine Reihe von Prozessen, einschließlich Chromatographie und Elektrophorese.
Reinigung von TPA aus Schweinenieren
- Dieses Protokoll wird in Studien zur Fibrinolyse verwendet, dem Prozess des Aufbrechens des Gerinnungsprodukts Fibrin, in Verbindung mit der Tumorbildung. Techniker extrahieren TPA aus acetone-getrockneten Schweinenieren mit Kaliumacetat-Puffer bei pH 4,2. Dann fügen sie Ammoniumsulfat hinzu, um Zellpräzipitation zu induzieren. Sie fügen N-Butyl-Sepharose zu den Proben hinzu, die dann auf einem Chromatographen analysiert werden. Concanavalin A wird ebenfalls hinzugefügt, und eine Chromatographie zur Trennung verschiedener Proteine wird durchgeführt.
Reinigung von TPA aus Chinesischen Hamster-Eierstockzellen und E. coli-Zellen
- Die Proteinreinheit ist ein wichtiger Faktor für den Erfolg biologischer Experimente. Gereinigtes TPA ist auch kommerziell erhältlich, was Zeit spart und das Risiko vermeidet, das Experiment durch schlecht gereinigte Lösungen zu gefährden. Dieses Protokoll umfasst die Reinigungsprozesse von TPA in Säugetier- und Bakterienzellen. Techniker präzipitieren Zellproben, filtern sie und führen Affinitäts- und Gelchromatographie-Analysen durch. Später analysieren und vergleichen sie die Ergebnisse, bevor die kommerzielle Produktion erfolgt.
Expression von aktivem humanem TPA in E. coli
- Geklärte Zelllysate werden auf eine Lysin-Sepharose-Säule gegeben, in einem Chromatographen analysiert und mit einer Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Eine weitere Probe wird auf eine zweite Chromatographiesäule geladen, die Proteine enthält, die mit sehr hoher Affinität an TPA binden. Eine Probe aus der zweiten Säule wird mit einer Zink-Sepharose-Lösung gemischt. Das resultierende Protein weist laut der Zeitschrift „Applied and Environmental Microbiology“ eine Reinheit von mehr als 90 Prozent auf.
